The progression of the tubulointerstitial damage in canine renal diseases

Kidney lesions can primarily involve the glomeruli, tubulointerstitium, or renal vessels. However, regardless of the initiating site of injury, all compartments often eventually become affected. Tubulointerstitial damage (TID) plays a central role in the progression of renal diseases, leading to an irreversible decline in renal function and ultimately resulting in end-stage renal disease (ESRD). TID is characterized by loss of renal tubules, increased number of interstitial myofibroblasts, and accumulation of extracellular matrix (ECM) in the interstitium usually with chronic inflammatory cell infiltrate. This project aimed at investigating different aspects of the progression of chronic TID in canine renal diseases. The first part of the project consisted in a morphological study describing the progression of renal lesions in canine Leishmaniosis possibly representing a model of TID progression in infectious immune-mediated glomerulonephritis. Renal biopsies taken at the beginning and after a 60-day period specific leishmanicidal treatment were evaluated. Progression of the TID was overall mild but present in half of the dogs especially those that had severe TID already at the first biopsy. The results further confirmed that the progression of the chronic TID is independent from the persistence of the causative agent. Moreover, elimination of the etiological agent, by means of the leishmanicidal treatment is not responsible for a significant improvement of renal lesions when these are severe and include irreversible changes like the presence of obsolescent glomeruli andd fibrosis. In contrast the positive effect of the treatment seems to occur in case of mild TID and is possibly related to the reduction of the inflammatory component. The second part of the project focused on the role of tubular epithelial cells (TECs) in the progression of chronic TID. Morphological diagnosis, severity of inflammation, interstitial fibrosis, HLA-DR expression by TECs and clinicopathological variables were compared in renal biopsies from dogs with spontaneous kidney diseases of varying severities and etiologies. Fibrosis, HLA-DR expression, serum creatinine concentration (SCr), and urine protein-to-creatinine ratio (UPC) were all increased in dogs with primary glomerular disease compared with dogs with acute tubular necrosis. HLA-DR expression by TECs was positively correlated to fibrosis, inflammation, UPC, and SCr. The study provided evidence of the capacity of TECs of acting as non-professional antigen presenting cells (APCs) in chronic TID, identifying a potential causative effect of the proteinuria. Moreover, this expression of TECs seems to precede and partially overlap with the process of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and potentially represents a phase of the EMT process itself. The last part of the project investigated and described the progression of TID in a canine model of CKD and was conducted in partnership with the Texas A&M University (College Station, TX, USA). The included dogs were members of a single family affected by a X-linked hereditary nephropathy (XLHN) caused by a mutation in the gene encoding the α5 chain of type IV collagen, which is a crucial component of normal glomerular basement membranes (GBM). The salient clinical and pathological features of the nephropathy that occurs in male dogs with XLHN include juvenile onset of proteinuria and renal failure rapidly progressive to ESRD. Aims of the study were to examine the evolution of renal injury and the expression of selected molecules potentially involved in the progression of chronic TID. Affected dogs were characterized by progressive loss of glomeruli mostly undergoing cystic glomerular atrophy and less commonly global glomerulosclerosis. Primary lesions into the glomerulus were mesangial matrix expansion and hypercellularity. The tubulointerstitial lesions included changes typical of chronic TID, like tubular necrosis and atrophy, interstitial fibrosis and inflammation. The obtained results suggested that two different phases of the disease can be identified. The first was classified as an “early” phase (4 months of age), characterized by minimal or absence of histopathological lesions but evident proteinuria that is characterized by TGFβ, CTGF, and PDGFRα overexpression, likely produced by podocytes and TECs in response to the glomerular damage and intratubular proteinuria. The second “advanced” phase (after 6 months of age) was characterized by prominent glomerular and tubulointerstitial changes associated with an upregulation of clusterin and TIMP1 by TECs. The obtained results significantly improved the understanding of the progression of chronic TID in canine renal diseases pointing out the importance of proteinuria and possibly other molecular changes that precede the morphological changes. More data are needed to further understand the mechanisms responsible for the initiation ad promotion of the secondary TID and the major cellular and molecular players involved in order to identify early and specific markers of renal damage, improve the time of the diagnosis and eventually new targets for therapy.

Un danno renale primario può coinvolgere uno dei comparti del tessuto renale: glomerulare, tubulointerstiziale o vascolare. Tuttavia, indipendentemente dalla struttura anatomica primariamente colpita, tutte le componenti del tessuto renale possono venire secondariamente coinvolte. Il danno tubulointerstiziale cronico svolge un ruolo centrale nella progressione del danno renale e nell’irreversibile declino della funzionalità renale risultante nella Malattia Renale Cronica. Morfologicamente il danno tubulointerstiziale cronico è caratterizzato da perdita del parenchima funzionale, in cui si osserva marcata atrofia tubulare ed espansione dell’interstizio dovuto ad aumento del numero di fibroblasti e accumulo di matrice extracellulare. Spesso in associazione si rileva infiltrato infiammatorio cronico di entità variabile. Il progetto di dottorato è stato suddiviso in tre parti e ha avuto come obiettivo lo studio della progressione del danno tubulo-interstiziale cronico nelle patologie renali del cane. In una prima fase si è analizzata l’evoluzione delle lesioni renali in soggetti con glomerulonefrite immunomediata associata all’infezione da Leishmania spp. Lo studio si è svolto su 14 cani Leishmania-positivi sottoposti ad un trattamento leishmanicida specifico della durata di 60 giorni e in cui si è ottenuta una duplice biopsia renale, pre-trattamento e post-trattamento. Complessivamente si è osservata lieve progressione delle lesioni renali in metà dei soggetti, particolarmente in quei pazienti caratterizzati da prominente danno tubulo-interstiziale già alla valutazione della biopsia pretrattamento. I risultati ottenuti forniscono ulteriore supporto alla tesi secondo cui la progressione del danno tubulo-interstiziale cronico è indipendente dalla persistenza dell’agente causale. Inoltre l’eliminazione dell’agente eziologico, conseguente al trattamento leishmanicida, non sembra essere responsabile di un significativo miglioramento delle lesioni e funzionalità renale soprattutto in caso di lesioni in stadio avanzato e quindi croniche e di gravi come nel caso di glomerulosclerosi globale e fibrosi interstiziale. Al contrario un’efficacia del trattamento farmacologico si è evidenziato in presenza di un danno tubulo-interstiziale lieve ed è apparentemente imputabile ad una riduzione della componente infiammatoria. Nella seconda fase del progetto, lo studio è stato focalizzato ad esplorare il ruolo delle cellule epiteliali tubulari nella progressione del danno tubulointerstiziale cronico. Lo studio è stato svolto su biopsie renali di cane affetti da patologie di diversa natura e gravità ricercando una correlazione tra le lesioni istopatologiche e la funzionalità renale, nonché la capacità delle cellule tubulari epiteliali di agire come cellule presentanti l’antigene. Si è potuto evidenziare che cani affetti da glomerulopatie primarie presentavano più comunemente un danno tubulointerstiziale cronico con fibrosi interstiziale e innalzamento dei parametri di creatinemia e proteinuria, così come si osservava l’espressione ex novo di HLA-DR da parte delle cellule epiteliali tubulari. Ulteriormente si è osservata una correlazione positiva tra l’espressione di HLA-DR nelle cellule epiteliali, il grado di fibrosi, d’infiammazione, e i valori di proteinuria e creatinemia. Lo studio ha evidenziato la capacità delle cellule epiteliali tubulari di agire come cellule presentanti l’antigene nel danno tubulo-interstiziale cronico. Si è inoltre identificata nella proteinuria un possibile agente causale nell’indurre questa capacità. Infine questa parte dello studio ha messo in luce che l’espressione di HLA-DR nelle cellule epiteliali tubulari sembra precedere e parzialmente sovrapporsi con il fenomeno di transizione epitelio-mesenchimale delle cellule epiteliali e potrebbe rappresentarne una fase iniziale. La terza parte del progetto ha descritto la progressione del danno tubulointerstiziale cronico in un modello canino di Malattia Renale Cronica ed è stato svolto in collaborazione con la Texas A&M University (College Station, TX, USA). Lo studio è stato svolto su cani con nefropatia ereditaria legata al cromosoma X e mantenuti in condizioni sperimentali presso la Texas A&M University (College Station – Texas – USA). Tale nefropatia è dovuta ad una mutazione del gene codificante per la catena α5 del collagene di tipo IV, che rappresenta uno dei principali componenti della membrana basale glomerulare. Le caratteristiche cliniche e patologiche della malattia renale in cani affetti da nefropatia ereditaria consistono nell’insorgenza precoce di proteinuria ed insufficienza renale, rapidamente progressive a Malattia Renale Cronica. Obiettivi del lavoro sono stati quelli di esaminare l’evoluzione del danno renale da un punto di vista morfologico, clinico patologico e tramite lo studio dell’espressione genica e proteica di fattori potenzialmente coinvolti nella progressione del danno. I soggetti patologici presentavano una progressiva aumento del numero di glomeruli atrofici cistici o, meno frequentemente globalmente sclerotici. Le lesioni primarie osservate a livello glomerulare consistevano in espansione del mesangio ed ipercellulatià mesangiale. Il tubulointerstizio era caratterizzato da lesioni croniche ed aspecifiche come la necrosi ed atrofia tubulare, la fibrosi interstiziale e l’infiltrato infiammatorio cronico. I risultati ottenuti suggeriscono che si possano distinguere due fasi della malattia renale nella nefropatia ereditaria studiata. Un fase “precoce” (4 mesi di età) in cui si sono osservate da lesioni morfologiche minime o assenti ma con proteinuria conclamata. Da un punto di vista molecolare in questa fase si è evidenziata una sovra-espressione di TGFβ, CTGF, and PDGFRα probabilmente prodotti da podociti e cellule epiteliali tubulari in risposta al danno glomerulare e alla proteinuria. Una seconda fase “avanzata” (dopo i 6 mesi di età) sarebbe invece caratterizzata da lesioni glomerulari e tubulointerstiziali conclamate e da una up-regulation di clusterina e TIMP1 ad opera delle cellule epiteliali tubulari. I risultati ottenuti forniscono nuove informazioni e aumentano la conoscenza dei meccanismi di progressione del danno tubulointerstiziale cronico nelle malattie renali del cane. Dal lavoro effettuato emerge che l’insorgenza di proteinuria e l’alterata espressione di alcune molecole sembra precedere la presenza di lesioni morfologiche. Ulteriori studi sono necessari per approfondire la nostra conoscenza dei meccanismi di iniziazione e promozione del danno tubulointerstiziale cronico, delle componenti cellulari e molecolari coinvolte con l’obiettivo di identificare marcatori di danno renale precoci e specifici e possibili target terapeutici per la gestione del paziente con insufficienza renale.