Engineered bovine herpesvirus type 4: a new tool against glioma stem-like cells?

Glioblastoma (GBM) is a grade IV primary brain tumor (WHO 2007). Despite last progresses in surgery, chemo- and radiotherapy, this brain tumor is still incurable and it always recurs (Stupp et al, 2009). It has been hypothesized that its resistance to therapies and its recurrence might be due to the existence of a subpopulation of tumor cells called Glioma Stem Cells (GSCs )(Galli et al, 2004; Bao et al, 2006). The goal of GBM therapy is the selective targeting of GSCs and, among the possibilities, the use of viral vectors has been widely investigated (Kroeger et al, 2010). Herpesviruses have been largely studied and modified in GBM treatment (Grandi et al, 2009). In this study the capacity of an engineered Bovine Herpesvirus type 4 (BoHV-4), named BoHV-4TKdsRED, to selectively kill GSCs has been investigated. The vector expresses the HSV-1 Thymidine Kinase and so it can be used with Ganciclovir (GCV) in a Suicide Gene Therapy protocol. Its potential role as a vector in GBM treatment has already been demonstrated (Redaelli et al, 2012). Three different primary cultures of human GSCs (GBM2, GBM4 and GBM5) and the corresponding serum-cultured cells (FBS2, FBS4 and FBS5) were used. They have been infected with BoHV-4TKdsRED and a combined treatment of the vector with GCV has also been tested on GSCs. It has also been analyzed whether signaling pathways of apoptosis or autophagy are activated in infected GSCs. To verify the BoHV-4TKdsRED effect on the cells counting/killing assays, plaque assays, Western Blot analysis and FACS analysis have been done. BoHV-4TKdsRED is able to infect GSCs and FBS cells. It can slightly replicate in almost all cultures examined and it can kill them in vitro. The combined treatment of the vector with GCV leads to an increased mortality in GSCs. Initial signs of autophagy activation were detected with the combined treatment in GSCs. Study of apoptosis through FACS analysis led to unreliable results. Another BoHV-4-derived vector, BoHV-4EGFPΔTK, demonstrated its ability in infecting selfrenewing cells, but without exerting a cytopathic effect. According to our results, BoHV-4TKdsRED would be a promising vector to target GSCs, but further analysis should be performed to strengthen these data.

Il Glioblastoma (GBM) è un tumore cerebrale primario di IV grado (WHO 2007). Nonostante gli ultimi progressi in chirurgia, chemioterapia e radioterapia, questo tumore al cervello è ancora incurabile e recidivante (Stupp et al, 2009). È stato ipotizzato che la sua resistenza alle terapie e le recidive potrebbero essere dovute all'esistenza di una sottopopolazione di cellule tumorali, denominata cellule staminali di glioma (Glioma Stem Cells - GSC) (Galli et al, 2004; Bao et al, 2006). L'obiettivo della terapia del GBM è quindi il targeting selettivo delle GSCs e, tra le possibilità, l'uso di vettori virali è stata ampiamente studiato (Kroeger et al, 2010). Gli Herpesvirus sono stati ampiamente studiati e modificati per il trattamento del GBM (Grandi et al, 2009). In questo studio è stata valutata la capacità di un vettore ingegnerizzato dall’ Herpesvirus Bovino di tipo 4 (BoHV-4), chiamato BoHV-4TKdsRED, di uccidere selettivamente le GSC. Il vettore esprime la Timidina Chinasi di HSV-1 e quindi può essere utilizzato con il Ganciclovir (GCV) in un protocollo di terapia genica suicida. Il suo potenziale ruolo come vettore per il trattamento del GBM è già stato dimostrato (Redaelli et al, 2012). Sono stati utilizzati tre diverse colture primarie di GSC umane (GBM2, GBM4 e GBM5) e le corrispondenti cellule coltivate in siero (FBS2, FBS4 e FBS5). Sono state infettate con BoHV- 4TKdsRED ed è stato testato anche un trattamento combinato del vettore con GCV sulle GSCs. È stato anche analizzato qualora vie di segnale di apoptosi o autofagia vengano attivate nelle GSCs infettate. Per verificare l'effetto di BoHV-4TKdsRED sono stati compiuti saggi di counting/killing, saggi di placca, Western Blot e analisi FACS. BoHV-4TKdsRED è in grado di infettare le GSCs e le cellule FBS. Può replicarsi in quasi tutte le colture esaminate e le può uccidere in vitro. Il trattamento combinato del vettore col GCV porta ad un aumento della mortalità nelle GSCs. Segni iniziali di attivazione dell'autofagia sono stati rilevati con il trattamento combinato nelle GSCs. Lo studio dell’apoptosi attraverso analisi FACS ha dato risultati non affidabili. Un altro vettore derivato da BoHV-4, BoHV-4EGFPΔTK, ha dimostrato la sua capacità di infettare le cellule self-renewing, ma senza esercitare un effetto citopatico. Secondo i nostri risultati, BoHV-4TKdsRED potrebbe essere un promettente vettore per le GSCs, ma ulteriori analisi devono essere effettuate per rafforzare questi dati.