G-quadruplexes in the HSV-1 and HHV-6 genomes as antiviral targets

Guanine-rich nucleic acids can fold into G-quadruplexes, four-stranded secondary structures which are implicated in important regulatory functions at the genomic level in humans, prokaryotes and viruses. Because the herpes simplex virus-1 (HSV-1) genome is remarkably rich in guanines, we aimed at investigating both the presence of G-quadruplex forming sequences at the viral genome level and the possibility to target them with G-quadruplex ligands to obtain anti-HSV-1 effects with novel mechanisms of action. Here we show that HSV-1 displays six clusters of repeated sequences that form very stable G-quadruplexes. These sequences are located in the inverted repeats and in two gene-coding regions (ICP0 and UL36) of the HSV-1 genome. One G-quadruplex repeat is located in the promoter region of the multifunctional protein γ134.5. Treatment of HSV-1 infected cells with the G-quadruplex ligands BRACO-19 and TMPyP4 induced significant inhibition of virus production and reduction of viral transcripts. BRACO-19 was able to inhibit Taq polymerase processing at G-quadruplex forming sequences in the HSV-1 genome, and caused a decreased intracellular viral DNA in infected cells. The last step targeted by BRACO-19 was viral DNA replication, while no effect on virus entry in the cells was observed. A different TMPyP4-mediated mechanism of action was on the contrary observed. Despite its capability to affect Taq polymerase processing, TMPyP4 did not inhibit intracellular viral DNA and it appeared to prevent HSV-1 maturation/egress by stimulating the autophagy process. As a second part of the study, we extended this innovative antiviral approach to human herpes virus-6 (HHV-6). One of the main HHV-6 features is the presence of tandem repeats of the telomeric sequence (TTAGGG)n at the genome termini (DR). This peculiarity is thought to be responsible for the viral integration in specific human chromosomes, occurring in the 1-2% of the world population. To date, the telomeric G-quadruplex structure had been extensively characterized. We showed that BRACO-19 and TMPyP4 displayed a great antiviral activity against both HHV-6A and HHV-6B. In the third part of this study, by using specific DNA G-quadruplex-interacting antibodies, for the first time we visualized viral DNA G-quadruplexes in infected cells at crucial time points for the viral replication cycle, in which viral DNA is likely in a single-stranded state. This work, besides presenting the first evidence of extended G-quadruplex sites in key regions of the HSV-1 and HHV-6 genomes, points out G-quadruplexes as innovative potential antiviral targets in novel therapeutic interventions, based on the use of G-quadruplex ligands.

Acidi nucleici ricchi di guanine possono formare una particolare struttura secondaria nota come G-quadruplex, il quale è implicato nella regolazione di importanti processi biologici a livello del genoma umano, di procarioti e virus. Dato che il genoma dell’herpes simplex virus-1 (HSV-1) è notevolmente ricco in guanine, il nostro studio è stato mirato all’individuazione di sequenze virali in grado di foldare in G-quadruplex e, in secondo luogo, alla possibilità di colpire selettivamente questa conformazione non-canonica con specifiche molecole chimiche, al fine di sviluppare una terapia antivirale innovativa. Il nostro studio dimostra la presenza di sei gruppi composti da sequenze altamente ripetute capaci di formare strutture G-quadruplex particolarmente stabili. Queste sequenze sono state individuate a livello delle regioni terminali del genoma di HSV-1 e all’interno di due regioni codificanti (geni ICP0 e UL36). Un cluster di sequenze G-quadruplex, inoltre, è situato nella regione promotoriale deputata all’espressione della proteina multifunzionale γ134.5. Il trattamento di cellule infettate con BRACO-19 e TMPyP4 ha mostrato una significativa inibizione di HSV-1 e una riduzione dell’espressione di alcuni trascritti virali. BRACO-19 si è dimostrato efficace nell’inibire l’elongazione di regioni G-quadruplex del genoma di HSV-1, da parte dell’enzima Taq; è stato in grado di diminuire il DNA virale intracellulare, opportunamente estratto da cellule infettate e trattate; inoltre, mentre nessun effetto è stato osservato sull’entry di HSV-1, l’ultimo step del ciclo virale inibito da BRACO-19 corrisponde alla replicazione del DNA virale. Un diverso meccanismo d’azione è stato, invece, osservato in seguito al trattamento con TMPyP4. Nonostante questa porfirina sia riuscita ad inibire l’attività della Taq, non è riuscita, al contrario, ad influenzare i livelli di DNA virali intracellulari. TMPyP4 sembra essere efficace nell’inibire la maturazione/uscita di HSV-1, attraverso un’induzione dell’autofagia. In una seconda parte dello studio, abbiamo esteso questa promettente strategia antivirale all’herpes virus umano 6 (HHV-6), il quale presenta una caratteristica molto peculiare. Ad entrambe le estremità del suo genoma (DR) contiene, infatti, numerose ripetizioni della sequenza telomerica umana (TTAGGG)n. Questa caratteristica è ritenuta responsabile dell’integrazione di HHV-6 in alcuni cromosomi umani (1-2% della popolazione). Ad oggi, la struttura G-quadruplex della sequenza telomerica è stata studiata in dettaglio e completamente caratterizzata. Abbiamo, quindi, testato BRACO-19 e TMPyP4 su cellule infettate sia con HHV-6A che HHV-6B, ottenendo anche in questo caso dei risultati molto incoraggianti. Infine, in una terza parte del lavoro, è stato possibile visualizzare per la prima volta G-quadruplex virali a livello del DNA in cellule infettate, grazie all’impiego di anticorpi ad alta affinità per questa struttura. La specificità di segnale è data dal fatto che l’incremento di fluorescenza è avvenuto nel corso della replicazione virale in cui il DNA è presente come singolo filamento. Questo lavoro, oltre a mostrare l’esistenza di estese regioni G-quadruplex in siti chiave del genoma di HSV-1 e HHV-6, mette in luce le potenzialità del G-quadruplex come target innovativo in terapie antivirali nuove e mirate, basate sull’impiego di leganti specifici per questa particolare conformazione secondaria del DNA.