Il sistema adrenomedullinico nel timo: un possibile nuovo target farmacologico nell'autoimmunità.

Background and aims: Adrenomedullin (ADM) is a peptide which exerts multiple biological effects by interacting with a functional receptor formed by the combination of the calcitonin receptor-like receptor (CRLR), a 7-transmembrane G protein-coupled receptor, with the receptor activity-modifying protein 2 (RAMP2), which dictates its ligand binding specificity. The thymus is a primary lymphoid organ which provides a variety of specialized microenvironments that support the production of self-tolerant T cells starting from immature precursors. Developing thymocytes and thymic epithelial cells (TECs) establish a mutual across talk that is necessary for the functional maturation of both types of cells. Given the growing appreciation of the importance of ADM in the immune system function, we investigated for the first time the expression and localization of ADM, CRLR and RAMP2 in primary cultures of TECs and thymocytes. Furthermore, we analyzed the ADM function in human thymus and the adrenomedullin system in a mouse model of psychiatric diseases, since psychosis has been associated with alteration of the immune function. Methods: Primary cultures of TECs and thymocytes were obtained from thymi of newborns with cardiac malformations. Expression and localization studies were performed by means of western blot analysis, immunofluorescence coupled to confocal microscopy and immunogold staining coupled to electron microscopy. The secretion of IL-6 from TECs undergoing pro-inflammatory stimuli was analyzed by means of an ELISA kit. Gene expressions of ADM, CRLR, RAMP2, IL-6 and p65 of a mouse model of psychiatric diseases (mice heterozygous for COMT and/or DAT) were analyzed by real-time PCR. Results and conclusions: We have for the first time demonstrated that both ADM and its receptor proteins CRLR and RAMP2 are expressed in newborn human thymus, notably in the nucleus of thymic epithelial cells. This localization was confirmed by western-blot analysis performed on cell fractions and by the lack of cAMP production in response to ADM exposure. AM, RAMP2 and CRLR could also be detected in thymocytes by means of double immunofluorescence coupled to confocal microscopy, although these proteins were not present in the whole thymocyte population. We demonstrated that ADM significantly reduces the release of IL-6 by TECs, by interacting with the NF-kB canonical pathway, since we observed an ADM-mediated reduction of p65 expression. In the mouse model of psychiatric diseases, we observed that the expression of the adrenomedullin system and the NF-kB-mediated production of IL-6 are differently modulated by the gender of mice: a significant increase in the gene expression of the adrenomedullin system, a decrease of NF-kB activation and IL6 production was observed in males heterozygous for DAT and COMT, whereas in females the expression of the adrenomedullin system decreased and activation of NF-kB and IL-6 production increased. In conclusion, we demonstrated that the ADM system is expressed in thymus, where it plays a role in the regulation of cytokine secretion by interacting with the canonical NF-kB pathway. This finding may open new avenues in the therapeutic management of autoimmune diseases and give new insight into the mechanism(s) by which the immune system may play a role in the onset of psychiatric diseases.

Introduzione e scopo: L'adrenomedullina (ADM) è un peptide che esercita molteplici effetti biologici interagendo con un recettore funzionale formato dalla combinazione del CRLR (calcitonin receptor-like receptor), un recettore accoppiato a proteine G con 7 domini transmembrana, con RAMP2 (receptor activity-modifying protein 2), porzione che conferisce al recettore la specificità  di legame per ADM. Il timo è un organo linfoide primario che costituisce il microambiente specializzato nella produzione di cellule T tolleranti verso il self a partire da precursori immaturi. I timociti e le cellule epiteliali timiche (TEC) stabiliscono una comunicazione reciproca, definita cross-talk, necessaria per la maturazione funzionale di entrambi i tipi di cellule. In questo lavoro sono state valutate per la prima volta l'espressione e la localizzazione di ADM, CRLR e RAMP2 in colture primarie di TEC e timociti. Inoltre, abbiamo analizzato la funzione di ADM nel timo umano e valutato espressione e funzione del sistema adrenomedullinico in un modello murino di malattie psichiatriche, che sono state spesso correlate ad alterazioni della funzione immunitaria. Metodi: Colture primarie di TEC e timociti sono stati ottenuti da timi di neonati con malformazioni cardiache congenite. Gli studi di espressione e localizzazione sono state eseguiti mediante analisi western blot, immunofluorescenza accoppiata alla microscopia confocale ed immunogold accoppiato a microscopia elettronica. Il rilascio di IL-6 da parte delle TEC è stato analizzato mediante ELISA. L'espressione genica di ADM , CRLR , RAMP2 , IL-6 e p65 in un modello murino di malattia psichiatrica (topi eterozigoti per COMT e/o DAT) è stata analizzata mediante real- time PCR. Risultati e conclusioni: In questo lavoro è stato dimostrato per la prima volta che sia l'ADM che le sue proteine recettoriali CRLR e RAMP2 sono espresse nel timo umano neonatale, in particolare nel nucleo delle TEC. Questa peculiare localizzazione è stata confermata mediante western-blot eseguito su frazioni cellulari e anche dalla mancanza di produzione di cAMP in risposta all'ADM. Le proteine del sistema adrenomedullinico sono state rilevate anche in alcuni timociti mediante doppia fluorescenza accoppiata a microscopia confocale. Abbiamo dimostrato che ADM riduce significativamente il rilascio di IL-6 operato dalle TEC, interagendo con la via canonica di NF-kB. E' stato infatti osservato che ADM induce una riduzione dell'espressione della proteina p65, una delle subunità  di NF-kB che trasloca nel nucleo in seguito all'attivazione della via canonica. Nel modello murino di malattia psichiatrica, è stato osservato che l'espressione del sistema adrenomedullinico e la produzione di IL-6 mediata da NF-kB sono influenzate dal genere dei topi. Infatti, è stato osservato un significativo aumento dell'espressione genica del sistema adrenomedullinico, con conseguente diminuzione di IL-6 e dell'attivazione di NF-kB nei maschi eterozigoti per DAT e COMT, mentre nelle femmine degli stessi genotipi diminuisce l'espressione del sistema adrenomedullinico e aumenta l'attivazione di NF-kB e la produzione di IL-6. In conclusione, abbiamo dimostrato che il sistema adrenomedullinico è espresso nel timo, dove svolge un ruolo nella regolazione della secrezione di citochine interagendo con la via canonica di NF-kB. Questa scoperta potrebbe aprire nuove strade nella terapia di patologie autoimmuni e dare nuova luce sul meccanismo mediante il quale il sistema immunitario gioca un ruolo nell'insorgenza di malattie psichiatriche.