A Model-Based investigation on the effect of Light on Microalgae Growth: Focusing on Photoproduction, Photoregulation and Photoinhibition

Biofuels derived from microalgae may represent a key source for alternative energy vectors. Moreover, microalgae exhibit a great potential for sustainable production of a wide range of commodities and value-added products, including cosmetics, pharmaceuticals and nutraceuticals, which makes them suitable for biorefinery applications. Their high productivity and their ability to accumulate large amounts of lipids, along with their independence from arable land, put them in a competitive position with respect to traditional oil crops. However, the economical and energetic sustainability of large scale microalgae cultivation for biodiesel production are still debated. The most optimistic previsions are in fact based on gross estimates of productivity, derived by extrapolation of laboratory-scale data. Therefore, the development of reliable mathematical models that are capable of quantitative predictions of the behaviour of large-scale outdoor microalgae culture is of paramount importance. Such models prove especially useful in identifying which parameters have the largest impact on productivity, thereby providing a means for enhancing the growth conditions through design and operational changes. Moreover, accurate forecasts of microalgal growth in the outdoor conditions can lead to a better understanding of the real potential of microalgae-based biofuels. This Thesis aims of investigating the complex effect of light in the photosynthetic apparatus activity, and its effect on microalgae growth. The work presented in this Thesis follows two general lines. The first contribution has been to propose a general approach for model development. The proposed methodology guides the modelling effort in order to assure both an accurate representation of the calibration data, but most importantly also the identifiability of the model. The identifiability of a model, i.e. the possibility to estimate in accurate and reliable way its parametric set, is in fact, a necessary property for the model to be confidently used in process scale-up and optimization. The proposed methodology has been successfully applied to growth and fluorescence data of the sea water alga Nannochloropsis Salina. A second contribution is concerned with Pulsed Amplitude Modulation (PAM) fluorometry. A dynamic model of chlorophyll fluorescence has been developed. The model integrates photoproduction, photoregulation and photoinhibition processes in a semi-mechanistic way. The model has been calibrated against fluorescence data of a sample of the microalga Nannochloropsis gaditana. The proposed fluorescence model is capable of quantitative prediction of the state of the photosynthetic apparatus of microalgae in terms of their open, closed and damaged reaction centres under variable light conditions. Two promising application of the fluorescence model have also been analysed: (i) the model has been used for the prediction of photosynthesis rate versus irradiance (PI)-response curves based on PAM fluorometry; and (ii) a model based experiment design (MBDoE) approach has been followed to define new information rich PAM protocols to further validate and refine the model structure.

Nonostante la crisi finanziaria, il consumo energetico negli ultimi anni è continuato ad aumentare, spinto principalmente dall'aumento della popolazione mondiale e dalla crescita economica dei paesi in via di sviluppo (in particolare Cina ed India). Oltre a preoccupazioni riguardanti la limitatezza delle riserve di energia fossile, il problema del riscaldamento globale rende sempre più evidente l'insostenibilità ambientale dell'attuale sistema di approvvigionamento di energia. Particolarmente critico è il settore dei trasporti, che attualmente è quasi del tutto dipendente dal petrolio. L'elevata densità energetica fornita dai combustibili liquidi, infatti, lascia poco spazio ad alternative quali i motori elettrici o a biogas, almeno per quanto riguarda il breve e medio periodo. Uno dei principali vantaggi dei biocarburanti è precisamente quello di poter essere impiegati nei motori attualmente sul mercato in sostituzione ai combustibili fossili o miscelati ad essi e di poter sfruttare il sistema di distribuzione impiegato per i carburanti tradizionali. Tra le alternative disponibili per la produzione di biomassa idonea alla conversione in biocombustibili, le microalghe sono considerate una delle fonti di biomassa più promettenti. L'elevata produttività, l'indipendenza da terreni agricoli e la possibilità di utilizzare acque non potabili e non adatte alle coltivazioni (acqua di mare o salmastra), assieme alla capacità di alcune specie di microalghe di accumulare elevate quantità di olio, le rendono il candidato ideale. Tuttavia, la produzione su larga scala di microalghe in modo economicamente ed ambientalmente sostenibile richiede ancora un notevole lavoro di ricerca. Le previsioni più ottimistiche, infatti, sono basate su estrapolazioni da dati ottenuti in laboratorio, dove le condizioni di crescita sono notevolmente diverse da quelle in un sistema di produzione su larga scala. La disponibilità di modelli matematici in grado di prevedere il comportamento delle colture microalgali in sistemi di coltivazione industriali è quindi di primaria importanza per progettare, simulare e ottimizzare i processi di produzione. Per essere sufficientemente robusto e affidabile quando utilizzato in predizione, un modello matematico deve basarsi per quanto possibile su considerazioni di tipo meccanicistico e in secondo luogo deve essere identificabile (ovvero deve essere possibile stimare in modo univoco il set di parametri che lo caratterizzano). L'analisi di letteratura svolta sui modelli esistenti ha messo in luce alcune limitazioni che questa Tesi si propone di superare. Il primo limite individuato è che spesso i modelli letteratura sono, o eccessivamente semplificati, e quindi incapaci di descrivere in modo sufficientemente accurato il sistema considerato, o al contrario, estremamente complessi e quindi difficilmente identificabili. Di conseguenza, il primo obiettivo di questa Tesi (affrontato nel Capitolo 3) è stato quello di proporre uno schema generale in grado di guidare lo sviluppo di nuovi modelli, assicurando due caratteristiche fondamentali: la prima è che i modelli devono essere in grado di rappresentare i dati in modo preciso, la seconda è che il modello sviluppato deve essere identificabile sulla base dei dati disponibili. Un secondo limite evidenziato dall'analisi di letteratura riguarda invece l'utilizzo di misure di fluorescenza. Strumenti quali la fluorometria PAM (Pulsed Amplitude Modulation) rappresentano infatti lo stato dell'arte degli strumenti di analisi dei processi fotosintetici e hanno portato ad importanti scoperte in abito biologico negli ultimi 40 anni. Tuttavia, il loro utilizzo è spesso limitato ad analisi di tipo qualitativo e poco è stato fatto per lo sviluppo di modelli matematici in grado di fornire informazioni quantitative. Questo ha dato l'impulso alla seconda parte della Tesi (Capitoli 4-6) nella quale è stato sviluppato un modello dinamico in grado di rappresentare la fluorescenza della clorofilla in funzione dell'intensità luminosa. Il modello, tenendo conto dei processi di fotoproduzione, fotoregolazione e fotoinibizione, è in grado di fornire previsioni accurate del flusso di fluorescenza misurato in varie condizioni sperimentali e ha permesso la derivazione di relazioni quantitative tra le misure di fluorescenza e lo stato del fotosistema in termini di centri di reazione aperti, chiusi e inibiti. Inoltre, sono state studiate altre due importanti applicazioni del modello di fluorescenza. La prima riguarda la possibilità di predire la produttività fotosintetica basandosi su misure di fluorescenza, molto più veloci ed affidabili rispetto alle misure tradizionali. La seconda applicazione del modello riguarda invece l'utilizzo di tecniche di progettazione ottimale di esperimenti basate su modello (Model based experiment design, MBDoE) per la determinazione di esperimenti ottimali in termini di informazione contenuta in essi. Il lavoro di Tesi è organizzato secondo il seguente schema concettuale. Nel Capitolo 1 dopo aver inquadrato il panorama bibliografico di riferimento, vengono illustrate le principali limitazione degli attuali approcci modellistici usati per descrivere la crescita delle microalghe. Nel Capitolo 2 vengono illustrati i principali strumenti matematici e sperimentali utilizzati nel proseguo della Tesi. Dopo aver presentato uno schema generale per lo sviluppo di un modello matematico che sia sufficientemente affidabile e robusto vengono discussi i concetti di identificabilità a priori e a posteriori; i fondamenti teorici delle tecniche MBDoE e il metodo di stima parametrica basato sulla massima verosimiglianza. Nella seconda parte del capitolo vengono introdotte le misure di fluorescenza della clorofilla fornendo alcune informazioni biologiche di base necessarie a comprendere le fondamenta teoriche di questo tipo di misure. Nel Capitolo 3 viene sviluppato un modello in grado di rappresentare dei dati di crescita e di fluorescenza riguardanti la specie Nannochloropsis salina. Attraverso opportune tecniche di discriminazione è stato selezionato il modello più promettente tra dei candidati reperiti nella letteratura scientifica. Tale modello è stato ulteriormente modificato, da un lato per meglio rappresentare alcuni importanti fenomeni biologici, dall'altro per assicurare l'identificabilità strutturale del modello stesso. Il Capitolo 4 presenta un modello semi-meccanicistico della fluorescenza della clorofilla. Il modello considera i principali processi biologici che agiscono in tempi caratteristici compresi tra i millisecondi (fotoproduzione) e le ore (fotoinibizione). In particolare, vengono usate misure di fluorescenza PAM per sviluppare e calibrare il modello. Tra i vantaggi offerti da un modello matematico come quello proposto ci sono: (i) la possibilità di verificare le condizioni sotto le quali sono valide alcune ipotesi biologiche, correntemente utilizzate in letteratura; e (ii) stimare l'andamento del numero di centri di reazione inibiti durante l'esperimento di fluorescenza. Il Capitolo 5 propone un'estensione del modello sviluppato nel Capitolo 4. In particolare viene introdotto nel modello il processo di fotoacclimatazione e un'espressione per il calcolo della produttività fotosintetica in termini di evoluzione di ossigeno (curve PI). La simulazione dinamica delle curve PI ha messo in luce l'importanza del protocollo usato durante gli esperimenti per misurare l'evoluzione di ossigeno. Questo è un risultato particolarmente significativo dal momento che spesso in letteratura viene trascurato l'effetto della dinamica e l'utilizzo di curve PI viene fatto ipotizzando che esse rappresentino uno stato stazionario. L'analisi dei risultati ottenuti mostra invece come l'assunzione di tale ipotesi possa causare una sovrastima della produttività e debba essere pertanto evitata. Nel Capitolo 6 attraverso l'utilizzo di tecniche MBDoE la struttura del modello di fluorescenza viene ulteriormente raffinata e validata. Viene inoltre migliorata l'accuratezza della stima parametrica. Infine, un nuovo tipo di misure di fluorescenza, ottenute con un diverso tipo di fluorometro vengono utilizzate per caratterizzare meglio la dinamica della fotoproduzione. Il capitolo 7 conclude la Tesi riassumendo i principali risultati raggiunti e indicando possibili sviluppi futuri per proseguire la ricerca sull'argomento.