Strategies for the modulation of catalytic activity of Zn(II)-based artificial nucleases

In the present thesis, entitled “Strategies for the modulation of catalytic activity of Zn(II)-based of artificial nucleases”, the results obtained in an extensive investigation on the reactivity of different catalytic systems for hydrolytic cleavage of phosphate diesters are reported. Phosphate diesters have a remarkable importance since they constituted the backbone of essential biomolecules as DNA and RNA. Indeed, the high stability of those polianions towards the hydrolytic attack is due to the presence of the phosphodiester group. On the other hand, the hydrolytic cleavage of nucleic acids occurs in living organism is few milliseconds, thanks to nucleases which are the enzyme devoted to this task. In the attempt to reproduce the activity of such enzymes, which are among the most efficient present in nature, I focused my attention on the design and synthesis of catalytic agents based on metal ions, namely Zn(II) ions, and studying their reactivity towards a RNA model, the 2-hydroxypropyl-para-nitrophenyl phosphate (HPNP). In the first part of the thesis, the interesting results I obtained in the study of the reactivity of monometallic Zn(II)-based complexes towards HPNP are reported. The Zn(II) complexes used in this studied were 1 (mononuclear complex of 1,4,7-triazacyclononane, TACN) and 2, (mononuclear complex of 1,4,7-trimethyl-1,4,7-triazacyclononane, TMTACN) which is the corresponding permethylated derivative. I will show how the small differences in the structure of the two ligands affect the HPNP cleavage reaction with effects never reported before. The hypothesis that such differences may arise from different coordination geometries of the metal will be discussed. The second part of the thesis is focused on the investigation of the effects that the local environment surrounding the metal complexes produces on their reactivity towards phosphodiester cleavage. In this view, I designed supramolecular systems based on functionalized gold nanoparticles. Such catalytic gold nanoparticles, known as nanozymes, were obtained by coating them with thiols bearing the a catalytic unit, namely the Zn(II) complex of the ligand TACN. Microenvironment modulation was obtained by changing the spacer between the catalytic unit and the anchoring part (thiol moiety). I will show that the increase the length of the alky spacer from four carbon atoms (thiol 1) to twelve atoms (thiol 4) strongly increases the nanozyme reactivity towards the hydrolytic cleavage of HPNP. On the other hand, longer but more polar oligo(ethyleneoxide) spacer in 3 does not have any effect on the nanozyme reactivity. The experiments reported will demonstrate that such a reactivity modulation depends on an enthalpy-driven stabilization of the transition state of the reaction and is strongly correlated to the polarity of the microenvironment, presumably the interface between the particle coating monolayer and the bulk water solution, where the reaction occurs. Finally, in the last part of the present thesis, I shall report the results obtained by studying how the morphology of the gold nanoparticles-coating monolayer affects the reactivity of the nanozymes. Therefore, I prepared mixed-monolayer nanoparticles where the coating contains simultaneously thiol 1 and the zwitterionic thiol (ZW), which bears a phosphorylcholine moiety, or the triethilenglycol-thiol (TEG, in different ratios). The main function of the latter is to improve water solubility to the nanozymes, but I reasoned that they could have an effect on the reciprocal organization and sorting of the molecules in the monolayer. Indeed, preliminary experiments performed demonstrated that different distributions of the catalytic units in the nanoparticles surface, either in patches or random, were obtained when the two different inert thiols were used. Interestingly, such different distributions affect the substrate affinity of the catalytic system but not its activity. In conclusion, we have performed a systematic approach to study of how the reactivity of Zn(II) ions in hydrolytic phosphate-cleaving catalysts can be modulated using different strategies, ranging to the modification of the ligand structure to the control of the local microenvironment or of the catalyst reciprocal proximity using monolayer protected nanoparticles.

Questa tesi di dottorato riassume i risultati che ho ottenuto cimentandomi in un progetto di ricerca il cui obiettivo era l’individuazione di nuove strategie capaci di aumentare l’efficacia dei catalizzatori per l’idrolisi di diesteri fosforici. Questi catalizzatori, noti nella letteratura scientifica con il nome di “nucleasi artificiali”, erano nel mio caso costruiti a partire da complessi dello ione Zn(II) con leganti poliamminci. La struttura dei complessi utilizzati ha spaziato da piccoli sitemi mononucleari a complessi sistemi catalitici supramolecolari basati su nanoparticelle di oro (nanozimi). I diesteri fosforici sono di vitale importanza nella chimica biologica visto che formano parte dello scheletro di biomolecole essenziali come il DNA e il RNA. Queste macromolecole sono caratterizzate da un’alta stabilità contro la scissione idrolitica, utilie per garantire la preservazione dell’informazione genetica, che è dovuta proprio alla presenza dei residui fosfato. D’altra parte, l’idrolisi dei gruppi fosfodiesterei di DNA e RNA avviene negli organismi viventi in pochi millisecondi, grazie alle nucleasi, gli enzimi idrolitici preposti a questa reazione. Il nostro interesse è quello di riprodurre l’attività di questi enzimi con sistemi di origine sintetica. In particolari, siamo convinti che il miglior candidato per costituire il nucleo “attivo” di sistemi idrolitici artificiali sia lo ione Zn(II). Conseguentemente abbiamo preparato una serie di complessi di Zn(II) caratterizzati da strutture e filosofie di assemblaggio anche molto diverse e ne abbiamo studiato la reattività nel promuovere la scissione idrolitica di un modello di RNA, il 2-idrossipropil-p-nitrofenil fosfato (HPNP). Nella prima parte della tesi sono discussi gli interessanti risultato che ho ottenuto nello strudio della reattività di complessi monometallici di Zn(II) nella idrolisi dell’HPNP. I complessi studiati sono riportati in figura e sono semplici complessi monucleari dei leganti 1,4,7-triazaciclononano(TACN) e 1,4,7-trimetil-1,4,7-triazaciclononano (TMTACN). Gli studi effettuati dimostrano come le piccole differenze nella struttura dei due leganti portano a notevoli differenze nella reattività dei complessi. Nel corso della discussione sarà suggerito che tali effetti, mai descritti in precedenza, possano essere dovuti a diverse geometrie di coordinazione dello ione metallico. Nella seconda parte della tesi mi sono dedicata a studiare gli effetti prodotti dall’ambiente locale in cui i complessi vengono a trovarsi sulla loro reattività come catalizzatori della scissione idrolitica di esteri fosforici. In quest’ottica, ho progettato una serie di sistemi supramolecolari basati su nanoparticelle d’oro funzionalizzate. Queste nanoparticelle catalitiche, conosciute come nanozimi, sono state ottenute ricoprendo i nuclei di oro con tioli dotati di un gruppo reattivo, in particolare di un complesso di Zn(II) del legante TACN. La modulazione del microambiente di reazione è stata ottenuta modificando la struttura dei tioli utilizzati, ed in particolare lo spaziatore inserito tra l’unità catalitica ed il gruppo tiolo preposto all’ancoraggio alla superficie d’oro- I risultati riportati dimostreranno che l’aumento della lunghezza dello spaziatore da quattro atomi di carbonio (tiolo 1) a dodici atomi (tiolo 4) produce un notevole aumento della reattività di questi nanozimi nell’idrolizzare l’HPNP. D’altra parte, l’inserimento di uno spaziatore di tipo oligo(ossietilenica) (tiolo 3), più lungo ma anche più polare, non comporta alcun vantaggio in termini di reattività. La modulazione di reattività osservata dipende, secondo gli studi effettuati, da una miglior stabilizzazione, dovuta ad effetti di natura entalpica, dello stato di transizione della reazione. Tale stabilizzazione è fortemente correlata alla polarità locale del microambiente di reazione, presumibilmente l’interfaccia tra il monostrato e la soluzione acquosa. Nell’ultima parte della tesi descriverò i risultati ottenuti studiando come la morfologia dello strato che ricopre le nanoparticelle d’oro influenzi la reattività dei nanozimi. In questa prospettiva, ho preparato nanoparticelle di oro (2 nm il diametro del nocciolo metallico) coperte in proporzioni diverse con monostrati misti composti dal tiolo 1 ed da un tiolo dotato di un gruppo fosfoilcolina (ZW) o di un residuo di trietileneglicole (TEG). La funzione primaria di questi ultimi tioli è apportare solubilità acquosa al nanosistema ma mi era sembrato possibile che essi potessero anche influenzare la disposizione delle unità catalitiche sulla particella. In effetti, gli esperimenti effettuati in via preliminare mostrano che l’uso dei due tioli porta a diverse distribuzioni delle molecole di ricoprimento che si dispongono in modo casuale o formando “isole”. Queste diverse distribuzioni influenzano l’affinità dei nanozimi per il substrato HPNP ma non la sua attività idrolitica. In conclusione, in questa tesi ho descritto i risultati ottenuti nell’effettuare uno studio simultaneo e sistematico di diverse possibili strategie capaci di modulare la reattività di agenti idrolitici artificiali basati sullo ione zinco(II). I risultati ottenuti potranno aprire la strada a nuovi sviluppi capaci di portare alla realizzazione di sistemi dotati di efficacia realmente comparabile a quella degli enzimi.