Plant-inspired solutions for modern food technology: Ice Structuring Proteins from winter wheat

In a quest to find novel methods to improve food preservation, food companies product pipelines are largely driven by the growing customers’ request for natural solutions. To date, freezing is still the most efficient method to preserve perishable foods, without altering substantially its taste and texture and avoid the use of preservatives. The uncontrolled growth of ice crystals, pose however a serious risk for the stability of many frozen goods, threatening their integrity and sensorial features. A paradigm is represented by ice cream, whose ice crystals microstructure is fundamental to impart its characteristic mouthfeel, and as such, need to be preserved. A step forward toward the improvement of techniques to prevent extensive ice crystals growth, was represent by the introduction, a few years ago, of AntiFreeze proteins also known as Ice Structuring Proteins (ISP). By directly interacting with the water molecules that make up the crystalline structure of ice, ISP disrupt the regularity of those planes and inhibit, to a certain extent, further addition of water molecules and consequent ice crystal growth. To date, the only case of application of ISP in commercial products, is that of a fish ISP produced by recombinant S. cerevisiae. Besides the technological advantages in ice cream manufacturing enabled by the use of this protein, being a GMO derived product hampered its diffusion in GMO-skeptical communities, like in Europe and other western countries. In this scenario, the aim of this doctoral project, in collaboration with the University of Padova with the support of Food Research & Innovation srl, was focused on finding novel ISP alternatives for preservation of frozen foods. The discovery of novel sources and methods to obtain ISP, were driven by two requirement that needed to be satisfied: 1) the ISP source had be perceived as “safe” from potential consumers, 2) the bioprocess to obtain those ISP compatible with industrial uses. On the basis of requirement n.1, we chose wheat as our preferred source of ISP and, after a thorough literature search about wheat ISP, we decided to start our investigation from a Triticum aestivum Thaumatin-Like Protein (TaTLP), for which the gene sequence was publicly available. The choice fell on TaTLP as this protein was previously recovered from wheat extracts, with the ability to inhibit ice recrystallization in ice cream. In contrast with data reported in literature for TaTLP isolated from the plant, the recombinant product didn’t show any ability to prevent ice crystals grow. After a thorough biochemical investigation, we concluded that the lack of activity wasn’t ascribable to incorrect processing or maturation of TaTLP, whose structural features resembled much that of other proteins belonging to the same family. Our hypothesis, is that TaTLP doesn’t exhibit any activity toward ice per se and that previous studies suggesting the opposite, may have derived from isolations of homologues TLP, that evolved ice binding domains. From our investigations on a wheat apoplastic extract containing ISPs, we found that the activity of those ISPs could be enhanced upon addition to the extract of exogenous proteins, not necessarily ISPs. At the moment, we don’t have strong experimental evidences to elucidate the mechanism at the molecular level, but we believe that some wheat ISPs, may have evolved a strategy to enhance their single contribution to the total ice growth inhibition activity of the plant. This enhancement may rely upon the interaction of wheat ISPs with other proteins, similarly to what was observed for AFP from the overwintering insect D. canadensis. In the search of a method to efficiently extract ISP from wheat that could be used as stabilizers of the ice phase in ice cream, we set up a one-step extraction process that involved high temperature treatment of the plant. This method represent a significant step forward in terms of simplicity and yield of ISPs, compared to previous extraction methods. Plus, the ISPs obtained thereof are heat resistant, an essential feature for proteins which are to be used in industrial foods. Wheat ISPs were then used to formulate ice cream in pilot pre-industrial plant; these ice cream were subjected to thermal shock to exacerbate temperature fluctuations experienced by ice cream in its path from the factory to the household freezers. The result is a stabilized ice cream, in which ice crystals growth was inhibited by the addition of a wheat extract containing ISPs. This extract could be considered as a natural ingredient, lacking the need to be declared as an additive and therefore not falling under the E-number labeling regulation for food ingredients. In parallel to the tests performed on ice cream, isolation and partial characterization of ISP active species from wheat extract were attempted. At the end of the purification process, comprising 3 consecutive chromatographic separations, 5 proteins were eluted in a single fraction showing activity towards ice crystals growth. Being that these proteins have very similar isoelectric points and electrophoretic mobility, we believe that they might be isoforms of the same species. To conclude, we designed a feasible process to obtain ISP from a vegetal source that successfully stabilized ice cream, this method having all the features required to be implemented on a larger scale for industrial production purposes. From the collateral results obtained from our investigations on wheat extracts, interesting clues about the nature of wheat ISP has emerged, as well and their possible roles in preventing ice growth in a physiological context. Those findings, contribute to broaden the knowledge of a category of ISP that is still poorly characterized and pose the basis for new research lines.

Nell’ambito della conservazione di prodotti alimentari, uno dei trend di mercato in continua espansione e che fonda le proprie basi sul costante incremento della domanda di mercato, riguarda lo sviluppo di soluzioni cosiddette “naturali”. Il congelamento è ad oggi l’unica tecnica di conservazione che consente di allungare la vita di cibi deperibili, senza alternarne sostanzialmente sapore e struttura e soprattutto senza ricorrere all’impiego di conservanti. La crescita incontrollata dei cristalli di ghiaccio pone un problema di stabilità del prodotto, che si ripercuote negativamente sulle proprietà qualitative dello stesso. Un caso emblematico è quello del gelato, in cui è indispensabile che la microstruttura di cristalli di ghiaccio venga mantenuta tale per garantirne la tipiche caratteristiche di palatabilità. Un contributo sostanziale alla tecnologia del controllo dei cristalli di ghiaccio avvenuto negli ultimi anni, è rappresentato dall’ introduzione delle cosiddette Proteine AntiFreeze, anche note come proteine Ice Structuring (ISP). Interagendo specificamente con le molecole d’acqua che costituiscono la struttura cristallina del ghiaccio, le ISP sono in grado di perturbarne la regolarità ed impedire, entro certi limiti, l’accrescimento incontrollato di cristalli di ghiaccio. L’unico esempio di ISP attualmente impiegata in ambito alimentare riguarda una proteina di pesce artico prodotta mediante tecnologia del DNA ricombinante con l’impiego di S. cerevisiae. Nonostante gli indubbi vantaggi e le possibilità che l’impiego di tale proteina ha consentito ai produttori di gelato, il suo successo in Europa e alcuni paesi occidentali è stato rallentato dalla diffidenza nei confronti dei prodotti a base di OGM. In questo scenario, alla base di questo progetto di ricerca, svolto nel contesto della scuola di dottorato presso l’Università degli Studi di Padova e grazie al contributo dell’azienda Food Research & Innovation srl, vi era la necessità di ricercare soluzioni alternative alle ISP già in commercio. Tali soluzioni dovevano necessariamente rispondere a due requisiti: 1) che le ISP venissero ricavate da fonti ritenute “affidabili” dal potenziale consumatore e 2) che il procedimento produttivo per l’ottenimento di tali ISP fosse compatibile con requisiti di applicabilità industriale. Sulla base del primo requisito, abbiamo scelto di utilizzare germogli di grano (T. aestivum) come fonte di ISP. Come prima cosa, a seguito di un’estensiva ricerca in letteratura delle ISP di grano, abbiamo scelto di partire con una Thaumatin-Like protein di Triticum aestivum (TaTLP), della quale era disponibile la sequenza genica. La nostra scelta è ricaduta su TaTLP, poiché tale proteina è stata ritrovata in estratti di grano con la capacità di inibire il processo di ricristallizzazione dei ghiaccio in campioni di gelato. Contrariamente a quanto riportato in letteratura sulla proteina isolata dalla pianta, la proteina ricombinante da noi ottenuta non ha alcun effetto sulla crescita dei cristalli di ghiaccio. A seguito di un’ approfondita caratterizzazione biochimica, abbiamo potuto stabilire che la mancata di attività non è da attribuire all’incorretta maturazione della proteina, che risulta strutturalmente e funzionalmente simile ad altre proteine appartenenti alla stessa classe. La nostra ipotesi è che la proteina in questione non abbia alcuna attività nei confronti dei cristalli di ghiaccio, e che gli studi precedenti si siano basati su proteine omologhe in cui tale attività è mediata da domini proteici specifici. A seguito di un indagine sperimentale su un estratto di ISP apoplastiche di grano, abbiamo scoperto che l’attività di tale proteine può essere incrementata, mediante l’aggiunta di proteine esogene all’estratto, non necessariamente ISP. Al momento, non siamo in possesso di solide evidenze sperimentali che ci consentano di validare un modello a livello molecolare. Tuttavia, riteniamo che alcune ISP di grano, possano aver evoluto un sistema per incrementare il proprio contributo, all’attività di prevenzione dalla crescita dei cristalli di ghiaccio a livello di organismo. L’incremento dell’attività delle ISP di grano potrebbe essere mediato dall’interazione diretta con altre proteine, in maniera simile a quanto riscontrato nel caso delle ISP ritrovate nelle larve dell’ insetto D. canadensis. Con lo scopo di identificare un processo per isolare le ISP dal grano da impiegare nella stabilizzazione del gelato, abbiamo messo a punto un procedimento di estrazione che consiste in una singola fase di estrazione a caldo dal materiale fogliare. Tale procedimento rappresenta un significativo miglioramento di processi estrattivi attualmente in uso, in ottica di semplicità del metodo e resa di ISP. Un ulteriore vantaggio è costituito dal fatto che al termine del processo, si ottengono ISP resistenti al calore, una caratteristica indispensabile per la loro applicabilità a cibi prodotti a livello industriale. Con le ISP ottenute in questo modo, sono stati preparati dei gelati in impianti pilota pre-industriali, i quali sono stati poi sottoposti a shock termico, per esasperare le fluttuazioni di temperatura che avvengono durante il ciclo di vita di un gelato, dal produttore al freezer del consumatore. Il risultato è un gelato stabilizzato in cui la crescita dei cristalli di ghiaccio dovuta allo stress termico è inibita mediante l’aggiunta di un estratto di grano come fonte di ISP. Tale estratto si configura come un ingrediente naturale, per il quale non è previsto un numero E con il quale vengono normalmente catalogati gli additivi alimentari. Parallelamente ai test sul gelato, abbiamo condotto una procedura di isolamento e caratterizzazione delle componenti ISP contenute dell’estratto. Al termine di un processo di purificazione che comprende 3 passaggi cromatografici, abbiamo ottenuto 5 specie proteiche che eluiscono in una singola frazione cromatografica ad alta attività. Date le simili proprietà di carica e peso molecolare verificate in gel bidimensionali, ipotizziamo che tali proteine siano isoforme di un’ unica specie. In conclusione, abbiamo definito un processo per l’ottenimento di ISP da fonte vegetale, compatibile con requisiti di produzione industriale ed efficacie nello stabilizzare il gelato. Dai risultati collaterali di questa ricerca sono emersi importanti informazioni in merito alla natura delle ISP di grano, così come spunti interessanti sul comportamento di queste proteine in un contesto fisiologico. Queste scoperte contribuiscono ad ampliare la conoscenza di una categoria di ISP sino ad oggi poco caratterizzata e pongono le basi per nuovi filoni di ricerca.