Microstructured polymeric substrates applied to human stem cells studies

Stem cells are undifferentiated cells that have the capability to differentiate into specialized cells and to subdivide indefinitely to produce more stem cells. Studies on human stem cells represent a powerful method to analyze biological and physiological processes specific of human cells, as well as for tissue engineering, regenerative medicine and cell therapies. When these studies are performed in vitro it is important to take in account that cellular processes such as adhesion, migration, growth, secretion, and gene expression are triggered, controlled, or influenced by the biomolecular three-dimensional organization of cell-surface contact. This organization cannot be straightforwardly reproduced in the laboratory; however modern methods in microtechnology enable researchers to generate complex environments at a biologically appropriate resolution. In this work we employ microfabricated and photopatterned polymeric substrates to reproduce a 3D environment morphologically and chemically tuned to induce specific cell responses (from cell adhesion to cell shape) and to detect specific biological parameters relevant for human stem cells both at the pluripotent and at the differentiated stage. In particular, at the pluripotent stage, we focus our attention on the response of the cell nucleus to specific microenvironments of the cells, as nuclear shape and structure are recognized to be deeply related with cell function during developmental, physiological and pathological changes which occur during the life time of the cells. The aim of our investigations is to understand if nuclear morphological reorganization caused by the microenvironment of the cell could affect the further behavior of the cells, especially the gene expression. We employ micropillared substrates where the pillar to pillar distance is smaller than the cell size and in some cases even smaller than the cell nuleus to compare nuclear behavior of human pluripotent stem cells (hPSCs) and differentiated cells, especially to elucidate to what extent the microenvironment influences the shape of the nucleus. Nuclear deformability is quantified by analyzing the shape of fluorescent labeled nuclei on images acquired by fluorescent or confocal microscopy. It is observed that the cell geometry of human pluripotent stem cells seeded on microstructured substrates is strongly altered by through contact with the microstructured substrates. This includes even a strong deformation of the nucleus that penetrates among the microstructures. In contrast to this, differentiated cells show much less deformable nuclei. To obtain information on a possible relationship between nuclear shape and cell function, we observe the nuclear shape and quantify nuclear deformability at the pluripotent stage and along the process of differentiation. In addition, we compare nuclear behavior and gene expression between cells seeded and differentiated on flat and on microstructured substrates. Our results show that pluripotency of hPSCs is maintained regardless whether the cells are seeded on flat or microstructured substrates. In contrast to this, gene expression analysis of endoderm, mesoderm and ectoderm germ layers, reveal that the morphological reorgaization of the nuclei, which is observed for cells seeded on microstructured substrates, can hinder the process of endoderm specification. Ectoderm and mesoderm early germ layer committment take place despite the highly deformed shape of the nuclei seeded on microstructured substrates, however ectoderm specification takes place along with a process of nuclear stiffening. Along ectoderm committment, cell nuclei raise up from micropillar interspaces and assume a round shape on top of the pillared surfaces. Such nuclear stiffening must be related to a structural and functional reorganization of cytoskeletal and nuclear envelope proteins. The use of a simple substrate fabrication approach combined with image analysis, allows to quantify variation in nuclear shape of hPSCs in a straightforward way. Thus, such approach can be combined in the future with a wider parallel analysis of protein expression to associate nuclear shape variation to specific changes in gene expression. The developed platform consisting of microfabrication and image analysis is also used to study a second system. We realize here a platform that allows the quantification of physiological parameters of cells derived by differentiation of hPSCs, to evaluate the functional maturation of the investigated cells. In particular, we focus our attention on cardiomyocytes derived from hPSCs. These cells are of special interest since heart diseases are the leading cause of mortality in the Western Countries. In the last decades much effort was put in the research for new approaches in treatment of infarcted hearts as well as congenital heart diseases, spanning from pharmacological to cell therapies. Both need reliable representative study models at the cellular level, as close as possible to the human physiology. To reach this goal we realize an in vitro set up that allows the simultaneous recording and analysis of calcium dynamics and contraction force of cardiomyocytes which have been directly derived from human pluripotent stem cells (hPSC-CMs). To tune cell response after seeding, we fabricate our substrates so that cell adhesion can be locally controlled. To this, we combine a cell-adhesive photopolymerizable elastomeric polymer, for the generation of a micropillared substrate obtained by replica molding, with a cell-repellent material. The cell-adhesive photoreactive polymer is a copolymer of n-butylacrylate and methacryloyl-4-oxy-benzophenone, P(nBA-co-%MABP). The cell-repellent polymer is polyacrylamide (PAA). To guide cell adhesion and shape, the cell-repellent PAA is attached and crosslinked to the rubber surface by UV light exposure through photolithography. The thus obtained substrate consists of elastomeric micropillars with cell-attractive pillar heads onto which hPSC-CMs selectively grew and aligne assuming an elongated shape. Calcium dynamics is acquired through confocal analysis, where the transient of calcium is detected by intensity changes of the fluorescent probe Fluo-A, which serves as a calcium indicator. Micropillar deflection caused by cellular contraction and relaxation is quantified by analysis of confocal images. The deflection data are converted into (contraction) force values by using a finite elements model. We apply the developed platform to compare calcium transient and contraction force of hPSC-CMs after 1 week and 5 weeks from seeding to study whether or not functional maturation of the cells occurrs in this time gap. This would be a crucial factor for their employment in drug testing and in the early pharmacological development pipeline. We report that hPSC-CMs cultured on our morpologically and chemically tuned substrates enhanced their functional properties from week 1 to week 5 of culture. In particular, the duration of the calcium transients was found to decrease, while the contraction force was found to increase on cells that were kept in culture for B weeks on microstructured and photopatterned substrates. The use of microtechnology techniques to provide controlled microenvironment combined with stem cells, such as hPSCs and hPSC-CMs goes into the direction to realize in vitro biological assays of cells that are sensitive to the mechanical stimuli from the environment. The generation of soft, deformable matrices with local control of the surface chemistry mimics more closely the behavior of regular cells under physiological conditions. As the cells used in a 3D-microenvironment study are actually human cells, it could be possible to limit errors caused by the difference between human and animal physiology. The described approach can reduce the need of more expensive and often not satisfactory in vivo studies, i.e. animal testing, where ethical aspects are under strong debate. Such replacement of animal testing could be used for drug screening and for fundamental studies of the mechanisms triggered in cells in response to topographical, chemical or mechanical modifications of the cell microenvironment

Le cellule staminali sono cellule non specializzate che hanno la capacitá di differenziare dando origine a diversi tipi di linee cellulari presenti nel corpo umano. L’impiego di cellule staminali permette di effettuare studi biologici, fsiologici, di ingegneria tissutale e di medicina rigenerativa su cellule umane derivate dalle staminali stesse. Tali studi sono spesso svolti in vitro. Quando si realizzano test in vitro é di fondamentale importanza tenere conto che i fenomeni di adesione, migrazione, crescita ed espressione genica a livello cellulare sono controllati o influenzati anche dalla tipologia di interazione che intercorre tra cellula e ambiente circostante. L’ambiente cellulare non puó essere riprodotto totalmente in laboratorio, tuttavia la microtecnologia permette di progettare e realizzare ambienti di coltura cellulare complessi. In questo lavoro vengono utilizzati substrati polimerici microstrutturati e fotopolimerizzati per realizzare un ambiente cellulare tridimensionale progettato dal punto di vista morfologico e chimico. La combinazione dell’aspetto morfologico e chimico induce particolari risposte cellulari e permette di individuare e analizzare determinati comportamenti cellulari in cellule staminali sia pluripotenti che differenziate. In particolare, tali substrati vengono impiegati per studiare la deformabilitá del nucleo delle cellule sotto esame, dato il fondamentale ruolo del nucleo nel determinare la funzione, lo sviluppo e i possibili aspetti patologici a livello cellulare. L’obiettivo del nostro studio sui nuclei é quello di determinare se variazioni della morfologia del nucleo (indotte dalla specifica struttura tridimensionale dei substrati utilizzati per svolgere gli esperimenti) in cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), possano influenzare il normale comportamento e sviluppo cellulare. Per indurre variazioni morfologiche a livello nucleare si utilizzano substrati caratterizzati da micropillars aventi una distanza da pillar a pillar inferiore alla dimensione media dei nuclei. La deformabilitá nucleare é quantificata a partire da immagini acquisite al microscopio confocale tramite utilizzo di semplici algoritmi che analizzano la forma dei nuclei. La nostra analisi mostra come la morfologia dei nuclei di hPSCs sia notevolmente alterata rispetto alla fisiologica forma rotondeggiante quando tali cellule vengono coltivate su sibstrati microstrutturati. Al contrario le cellule differenziate mostrano una deformabilitá molto piú bassa. Per ottenere informazioni relative ad una possibile relazione tra morfologia nucleare e funzione cellulare, la deformabilitá cellulare é quantificata nei diversi stadi di differenziamento. Inoltre, la morfologia cellulare e l’espressione di alcuni geni viene confrontata tra cellule differenziate su substrati microstrutturati e tra cellule differenziate su substrati piatti. I nostri dati mostrano che la pluripotenza cellulare è mantenuta quando le cellule vengono coltivate su substrati microstrutturati cosí come quando vengono coltivate su substrati piatti. Al contrario, l’analisi dell’espressione genica realizzata su cellule dove é stato indotto il processo di sviluppo dei foglietti germinali (endoderma, ectoderma e mesoderma), rivela che la riorganizzazione morfologica dei nuceli osservata nel caso di cellule coltivate su substrati microstrutturati, puó ostacolare un normale processo di induzione del foglietto germinale endoderma che sembra essere ostacolato dalla deformazione dei nuclei. Il processo di specializzazione cellulare in ectoderma e mesoderma avviene invece anche nel caso di cellule seminate su substrati microstrutturati dove i nuclei assumono forti deformazioni morfologiche. Tuttavia il processo di differenziamento in ectoderma avviene in concomitanza con un processo di irrigidimento del nucleo che assume forme tondeggianti e non é piú in grado di adattarsi alla geometria del substrato. Questo irrigidimento del nucleo deve essere correlato ad un processo di riorganizzazione strutturale e funzionale a livello della membrana cellulare e del citoscheletro. Il nostro studio mostra come combinando l’utilizzo di substrati microstrutturati ad un semplice processo di analisi delle immagini dei nuclei acquisite al confocale, si possono monitorare e quantificare facilmente e in maniera affidabile variazioni della deformabilità nucleare. Questo approcio, se combinato ad una piú ampia analisi dell’espressione genica a livello cellulare, potrá permettere di correlare variazioni della morfologia nucleare a variazioni funzionali e di espressione genica a livello cellulare. La combinazione di substrati microstrutturati con l’analisi di immagini acquisite al confocale viene utilizzata anche per un secondo obiettivo. Abbiamo realizzzato una piattaforma in grado di quantificare importanti parametri fisiologici di cardiomiociti derivati dal differenziamento di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CMs). Tale piattaforma é in grado di ottenere in maniera simultanea la dinamica del calcio e la forza di contrazione dei cardiomiociti. I cardiomiociti, grazie alla specifica chimica della superficie del substrato, assumono una forma allungata, simile a quella fisiologica, una volta seminati. Il substrato é stato realizzato in un elastomero fotopolimerizzabile, che promuove l’adesione cellulare. Tale polimero é costituito da n-butilacrilato e da metacriloil-4-oxi-benzofenone P(n-BA-co-%MABP). Con questo polimero sono stati realizzati substrati microstrutturati che presentano dei micropillar. Un sottile strato di poliacrilamide (PAA) é stato poi fotopolimerizzato tramite esposizione alla luce UV su tutto il substrato, eccetto che in aree rettangolari che si estendono da un micropillar all’altro. I nostri dati mostrano che quando gli hPS-CMs vengono mantenuti in coltura sui nostri substrati per 5 settimane la durata del transiente del calcio diminuisce mentre la forza di contrazione aumenta rispetto alle stesse cellule mantenute in coltura per 1 settimana. Tali dati suggeriscono che la combinazione di diversi fattori quali la morfologia della cellula, il tempo di coltura e lo stimolo meccanico dato dai micropillar elastici inducono un processo di maturazione funzionale a livello cellulare. L’impiego della microtecnologia per realizzare un ambiente cellulare ad hoc combinato con l’impiego di cellule staminali va nella direzione di realizzare test in vitro sempre piú complessi e che possano dare informazioni sempre piú specifiche e affidabili. Tale approccio puó permettere la riduzione di test in vivo che sono molto piú costosi, eticamente problematici e basati sul modello animale, che spesso presenta sostanziali differenze rispetto a quello umano