Background. Antiphospholipid (aPL) antibodies are a heterogeneous group of autoantibodies directed against plasma protein-phospholipid complexes or single plasma proteins. Their presence in patients with thrombosis and/or pregnancy morbidity defines antiphospholipid syndrome (APS). APS is considered as primary (PAPS) if present alone, or secondary if associated with other systemic autoimmune diseases, particularly with systemic lupus erythematosus (SLE). Laboratory criteria for APS classification include lupus anticoagulant (LA) and/or medium-high levels of IgG/IgM anticardiolipin (aCL) and/or medium-high levels of IgG/IgM anti-Beta2glycoprotein I (anti-Beta2GPI) antibodies, all confirmed no earlier than 12 weeks later. Currently, ELISA assay for detection of aCL and anti-Beta2GPI antibodies, despite several attempts, is not a standardized technique. Recently, few studies have compared the performance of ELISA with that of other technologies also fully automated including the fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) and the chemiluminescence immunoassays (CLIA), but they have produced debatable results. The search for new markers of APS through the use of laboratory techniques alternatives to ELISA, such as FEIA and CLIA methods is currently under interest. IgA aCL and IgA anti-Beta2GPI antibodies are not considered one of the recommended laboratory criteria for APS classification, and their clinical relevance is as yet controversial. Moreover, aPL are not only considered as a tool for APS classification, but they could be useful parameters to stratify the risk for developing clinical manifestations of the disease. In particular, anti-anti-Beta2GPI antibodies directed against the Domain I (anti-DI) of the molecule, were reported to be associated to thrombotic risk in antiphospholipid syndrome (APS), so correlating them with a more severe clinical picture. Objectives. The aim of the study was to compare the performance of a home-made ELISA with that of FEIA and CLIA assays in detecting aCL and anti-Beta2GPI antibodies in a large, homogeneous cohort of PAPS patients and in a group of subjects with clinical criteria for APS classification but ELISA negative for laboratory criteria. The results were compared with those obtained in a control group including healthy blood donors and patients with autoimmune diseases different from APS. Subsequently, the clinical relevance of IgA aCL, IgA anti- Beta2GPI antibodies and of IgG anti-DI antibodies was evaluated in a large homogeneous cohort of PAPS patients. Their diagnostic sensitivity was investigated in a group of seronegative patients for conventional aPL but with clinical manifestations of APS. Moreover, prognostic value of these antibodies in APS patients was studied. Methods. IgG/IgM/IgA aCL and IgG/IgM/IgA anti-Beta2GPI antibodies were determined using FEIA, (EliA TM, Phadia AB, Sweden). aCL/anti-Beta2GPI of IgG isotype and IgG anti-DI antibodies were assayed using CLIA (HemosIL AcuStar®, Inova, USA). The manufacturer's recommendations were followed carefully for both techniques. A home-made ELISA performed following the European Forum on aPL recommendations was used for the comparison between methods. All sera were also tested for LA following updated guidelines using diluted Russell viper venom time and diluted activated partial thromboplastin time as screening tests. Results and Conclusions. (1) Comparison between an ELISA home made and FEIA technique. The sensitivities of the ELISA and FEIA tecniques were similar with the exception of IgM aCL which was found to be significantly higher in the PAPS patients using the ELISA method. The two assays had a comparable specificity, a high significant agreement and a significant correlation between the antibody levels. FEIA testing uncovered no significant prevalence of any antiphospholipid antibody in the ELISA negative patients. In conclusion, our results suggest that FEIA tecnique is comparable to a home-made ELISA. If confirmed by large scale studies on PAPS patients, these results could support FEIA's routine use in detecting aCL and anti-Beta2GPI antibodies. Results and Conclusions. (2) Comparison between an ELISA home made and CLIA technique. When compared with the ELISA technique, it came to light that the CLIA method had a significantly lower sensitivity for IgM aCL and IgG/IgM anti-Beta2GPI antibodies; while, its specificity was higher with respect to ELISA for IgM aCL and IgM anti-Beta2GPI antibodies. The two techniques showed a high, significant agreement and a significant antibody titer correlation. CLIA also detected IgG/IgM aCL and IgG anti-Beta2GPI antibodies in the seronegative patients using ELISA method. There was a significantly higher prevalence of IgG aCL and IgG anti- Beta2GPI antibodies in those patients with respect to that in the control population. In conclusion, despite a lower sensitivity, CLIA showed a higher specificity for some aPL and a good level of agreement and correlation with a home made ELISA. CLIA also detected some aCL and anti-Beta2GPI antibodies in the seronegative patients not usually identified by home made ELISA. If confirmed by further studies, CLIA could be considered a valuable method to assess patients with clinical manifestations of APS but testing negative for aPL using a home made ELISA. Results and Conclusions. (3) ACL and anti-Beta2GPI antibodies of IgA isotype. Present respectively in 19% and 50% of the PAPS patients studied, IgA aCL and IgA anti- Beta2GPI antibody frequencies were both statistically significant .The mean titers of both IgA aCL and IgA anti-Beta2GPI antibodies were higher in the thrombotic patients, but only the latter were significantly associated with thrombosis. When analyzed, the patients FEIA negative for conventional IgG/IgM aPL, but with the clinical features of APS, in 10.6% of cases were tested positive for anti-Beta2GPI IgA, this data was found to be significant. In conclusion, positivity to IgA anti-Beta2GPI antibody detected using FEIA was found to be clinically relevant in PAPS patients. Moreover, the prevalence of isolated IgA anti- Beta2GPI antibody positivity was significant in the seronegative patients. These results suggest that patients with clinical signs/symptoms of APS but who do not meet conventional antiphospholipid antibody laboratory criteria could undergo at least of IgA anti-Beta2GPI antibody testing using FEIA technique. Results and Conclusions. (4) IgG anti-DI antibodies. The sensitivity and specificity of IgG anti-DI antibodies were comparable to those of IgG aCL and IgG anti-Beta2GPI antibodies. There was a significant agreement, association and antibody titre correlation between IgG anti-DI and IgG aCL as well as IgG anti-Beta2GPI antibodies. IgG anti-DI antibody showed lesser prevalence and mean titres in the pregnancy morbidity than in thrombotic and PAPS patients with both involvements. Regarding the conventional aPL antibody profiles, the triple positivity group had higher prevalence and mean titres than single and double positivity ones. In conclusion, as regards the anti-DI antibodies this study provides further evidence that these antibodies detected by CLIA, can be considered a promising biomarker for risk assessment particularly in patients having vascular thrombosis and triple conventional aPL positivity, which is considered an antibody profile associated to the most severe features of APS. Thus, anti-DI antibodies might constitute an additional useful tool in clinical and therapeutic decisions.

Introduzione. Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL) sono un gruppo eterogeneo di autoanticorpi specifici per complessi fosfolipide-proteina o proteine leganti i fosfolipidi. La loro presenza in pazienti con trombosi e/o complicanze ostetriche definisce la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS). L'APS viene considerata primaria (PAPS) se presente in forma isolata, altrimenti secondaria se associata ad altra malattia autoimmune sistemica che solitamente e' il lupus eritematosus sistemico (LES). I criteri di laboratorio per la classificazione di APS includono la presenza di tre aPL ed in particolare del lupus anticoagulant (LA) e/o di livelli medio-alti di anticorpi anticardiolipina (aCL) IgG/IgM e/o di livelli medio-alti di anticorpi anti-Beta2glycoproteina I (anti-Beta2GPI) IgG/IgM, tutti confermati non prima di 12 settimane. Attualmente, le metodiche ELISA per la determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM, nonostante svariati tentativi, non sono ancora standardizzate. Di recente, alcuni studi hanno confrontato le performance dei test ELISA con quelle di altre tecnologie anche completamente automatizzate tra le quali rientrano sia il fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) che il chemiluminescence immunoassay (CLIA). Questi lavori, tuttavia, hanno prodotto risultati non concordanti. Gli anticorpi aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA non sono ancora considerati criterio di laboratorio per la classificazione dell'APS e la loro rilevanza clinica e' al momento oggetto di dibattito. Inoltre gli aPL non sono considerati soltanto strumenti di classificazione dell'APS, ma anche parametri per la stratificazione del rischio di sviluppare le manifestazioni cliniche della malattia. In particolare, gli anticorpi anti-Beta2GPI specifici per un preciso epitopo situato nel Dominio I della molecola sembrano essere associati maggiormente al rischio di trombosi piuttosto che all'impegno ostetrico e di conseguenza sarebbero correlati a un quadro clinico piu' severo dell'APS. Obiettivi. Lo scopo della tesi e' stato di confrontare la performance di un ELISA home made con quella delle tecniche FEIA e CLIA nel rilevamento degli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG/IgM in un'ampia e omogenea coorte di pazienti affetti da sindrome da anticorpi antifosfolipidi primaria (PAPS) e in un gruppo di soggetti con i criteri clinici per la classificazione di APS ma ELISA negativi per i criteri di laboratorio. I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in un gruppo di controllo comprendente donatori sani e pazienti con malattie autoimmuni diverse dall'APS. Successivamente e' stata valutata la rilevanza clinica degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA e degli anticorpi anti-Dominio I (anti-DI) di isotipo IgG in un'ampia ed omogenea coorte di pazienti affetti esclusivamente da PAPS. Inoltre, la sensibilita'  diagnostica di questi anticorpi e' stata valutata in un gruppo di pazienti sieronegativi per gli aPL convenzionali, ma con manifestazioni cliniche di APS. Di entrambi gli anticorpi e' stato anche indagato il valore prognostico nell'ambito dell'APS. Metodi. Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM/IgA sono stati determinati usando il metodo FEIA (EliA TM, Phadia AB, Sweden). Inoltre gli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM sono stati anche analizzati assieme gli anticorpi anti-DI IgG utilizzando il metodo CLIA (HemosIL AcuStar®). Le raccomandazioni del produttore sono state seguite scrupolosamente per entrambe le tecniche. Per il confronto dei risultati ottenuti con le diverse metodiche e' stato usato un test ELISA home made, eseguito seguendo le raccomandazioni del Forum europeo sugli aPL. Tutti i sieri sono stati testati anche per LA seguendo le linee guida aggiornate utilizzando il tempo di veleno di vipera Russell ed il tempo di protrombina parziale attivata, entrambi con fosfolipidi diluiti, come tests di screening. Risultati e Conclusioni. (1) Confronto ELISA home made con FEIA. Le sensibilita'  delle tecniche ELISA home made e FEIA sono risultate essere simili ad eccezione degli aCL di classe IgM che sono risultati significativamente piu' frequenti nei pazienti PAPS con il metodo ELISA. I due metodi avevano una specificita' simile, un'elevata concordanza e una correlazione significativa tra i livelli anticorpali. Inoltre il metodo FEIA non ha rilevato alcuna significativa prevalenza degli anticorpi antifosfolipidi nei pazienti ELISA negativi, ma con manifestazioni cliniche di APS. In conclusione, questi risultati suggeriscono che il metodo FEIA e' paragonabile al test ELISA home made. Se confermato da altri studi su ampie casistiche di pazienti affetti da PAPS, questi risultati potrebbero supportare l'uso del FEIA nella determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI nell'analisi di routine. Risultati e Conclusioni. (2) Confronto ELISA home made con CLIA. Quando e' stata confrontata la tecnica ELISA home made con la tecnica CLIA, e' emerso che il metodo CLIA aveva una sensibilita' significativamente piu' bassa per gli aCL IgM e gli anti-Beta2GPI IgG/IgM rispetto a quella dell'ELISA; invece la sua specificita' e' risultata significativamente piu' alta per gli anticorpi aCL IgM e anti-Beta2GPI IgM. Le due tecniche hanno mostrato un'alta e significativa concordanza e una significativa correlazione dei titoli anticorpali. Inoltre il CLIA ha rilevato gli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi in ELISA. Vi era infatti una prevalenza di aCL IgG e di anti-Beta2GPI IgG significativamente maggiore nei pazienti sieronegativi con i criteri clinici di APS che nella popolazione sana di controllo. In conclusione, il metodo CLIA, nonostante una minore sensibilita', ha mostrato una specificita' piu' alta per alcuni aPL e un buon livello di concordanza e di correlazione con la metodica ELISA home made. Il CLIA, inoltre, e' stato in grado di rilevare gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi non identificati dall'ELISA. Se confermato da ulteriori studi, il CLIA potrebbe essere considerato un metodo valido per la valutazione di pazienti con manifestazioni cliniche di APS, ma con gli aPL negativi al test ELISA home made. Risultati e Conclusioni. (3) Gli aCl e gli anti-Beta2GPI di classe IgA: Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgA sono stati testati con il metodo FEIA e sono risultati sgnificativamente presenti rispettivamente nel 19% e nel 50% dei pazienti affetti da PAPS. I loro titoli medi erano piu' elevati nei pazienti con impegno trombotico rispetto alle pazienti con impegno ostetrico. Tuttavia solo gli anti-Beta2GPI IgA erano significativamente associati alla trombosi. Quando sono stati analizzati i pazienti FEIA negativi per aCL IgG/IgM e per anti-Beta2GPI IgG/IgM ma con le caratteristiche cliniche di APS, nel 10,6% di essi sono stati trovati gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA. Questo dato e' risultato essere significativo nel confronto con la popolazione sana di controllo. In conclusione, la positivita' per gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA definita con il metodo FEIA e' risultata clinicamente rilevante nei pazienti PAPS. Inoltre la presenza di anticorpi anti-Beta2GPI IgA era significativa nei pazienti sieronegativi per gli isotipi IgG e IgM. Questi risultati suggeriscono che nei pazienti con segni/sintomi clinici di APS, ma che non soddisfano i criteri di laboratorio per gli anticorpi antifosfolipidi convenzionali si potrebbero determinare gli anticorpi anti-Beta2GPI di classe IgA al fine di incrementare la sensibilita'  diagnostica per APS. Risultati e Conclusioni. (4) Gli anti-DI IgG: La sensibilita' e la specificita' degli anticorpi anti-DI IgG rilevati con il metodo CLIA erano paragonabili a quelle degli anticorpi aCL IgG e anti-Beta2GPI IgG. Si e' riscontrata una significativa concordanza, un'associazione e una correlazione dei titoli anticorpali degli anti-DI IgG con gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG. Inoltre gli anticorpi anti-DI IgG hanno mostrato una minore prevalenza e titoli medi piu' bassi nelle complicanze ostetriche rispetto ai pazienti con trombosi e ai pazienti con entrambi i coinvolgimenti clinici. Per quanto riguarda i profili anticorpali degli aPL convenzionali, il gruppo con la triplice positivita' antifosfolipidica ha mostrato una maggiore prevalenza e maggior titoli medi degli anticorpi anti-DI, rispetto ai gruppi con singola e duplice positivita'. In conclusione, gli anti-DI, rilevati con la tecnica CLIA, possono essere considerati dei promettenti biomarkers per la valutazione del rischio clinico di trombosi vascolare e di triplice positivita' per gli aPL convenzionali, solitamente associata ai quadri clinici piu' severi di APS. Pertanto, essi possono costituire uno strumento aggiuntivo utile per eventuali decisioni cliniche e terapeutiche.

Contributo alla determinazione degli anticorpi anticardiolipina e anti - beta2 glicoproteina I / Mattia, Elena. - (2015 Dec 28).

Contributo alla determinazione degli anticorpi anticardiolipina e anti - beta2 glicoproteina I

Mattia, Elena
2015

Abstract

Introduzione. Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL) sono un gruppo eterogeneo di autoanticorpi specifici per complessi fosfolipide-proteina o proteine leganti i fosfolipidi. La loro presenza in pazienti con trombosi e/o complicanze ostetriche definisce la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS). L'APS viene considerata primaria (PAPS) se presente in forma isolata, altrimenti secondaria se associata ad altra malattia autoimmune sistemica che solitamente e' il lupus eritematosus sistemico (LES). I criteri di laboratorio per la classificazione di APS includono la presenza di tre aPL ed in particolare del lupus anticoagulant (LA) e/o di livelli medio-alti di anticorpi anticardiolipina (aCL) IgG/IgM e/o di livelli medio-alti di anticorpi anti-Beta2glycoproteina I (anti-Beta2GPI) IgG/IgM, tutti confermati non prima di 12 settimane. Attualmente, le metodiche ELISA per la determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM, nonostante svariati tentativi, non sono ancora standardizzate. Di recente, alcuni studi hanno confrontato le performance dei test ELISA con quelle di altre tecnologie anche completamente automatizzate tra le quali rientrano sia il fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) che il chemiluminescence immunoassay (CLIA). Questi lavori, tuttavia, hanno prodotto risultati non concordanti. Gli anticorpi aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA non sono ancora considerati criterio di laboratorio per la classificazione dell'APS e la loro rilevanza clinica e' al momento oggetto di dibattito. Inoltre gli aPL non sono considerati soltanto strumenti di classificazione dell'APS, ma anche parametri per la stratificazione del rischio di sviluppare le manifestazioni cliniche della malattia. In particolare, gli anticorpi anti-Beta2GPI specifici per un preciso epitopo situato nel Dominio I della molecola sembrano essere associati maggiormente al rischio di trombosi piuttosto che all'impegno ostetrico e di conseguenza sarebbero correlati a un quadro clinico piu' severo dell'APS. Obiettivi. Lo scopo della tesi e' stato di confrontare la performance di un ELISA home made con quella delle tecniche FEIA e CLIA nel rilevamento degli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG/IgM in un'ampia e omogenea coorte di pazienti affetti da sindrome da anticorpi antifosfolipidi primaria (PAPS) e in un gruppo di soggetti con i criteri clinici per la classificazione di APS ma ELISA negativi per i criteri di laboratorio. I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in un gruppo di controllo comprendente donatori sani e pazienti con malattie autoimmuni diverse dall'APS. Successivamente e' stata valutata la rilevanza clinica degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA e degli anticorpi anti-Dominio I (anti-DI) di isotipo IgG in un'ampia ed omogenea coorte di pazienti affetti esclusivamente da PAPS. Inoltre, la sensibilita'  diagnostica di questi anticorpi e' stata valutata in un gruppo di pazienti sieronegativi per gli aPL convenzionali, ma con manifestazioni cliniche di APS. Di entrambi gli anticorpi e' stato anche indagato il valore prognostico nell'ambito dell'APS. Metodi. Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM/IgA sono stati determinati usando il metodo FEIA (EliA TM, Phadia AB, Sweden). Inoltre gli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM sono stati anche analizzati assieme gli anticorpi anti-DI IgG utilizzando il metodo CLIA (HemosIL AcuStar®). Le raccomandazioni del produttore sono state seguite scrupolosamente per entrambe le tecniche. Per il confronto dei risultati ottenuti con le diverse metodiche e' stato usato un test ELISA home made, eseguito seguendo le raccomandazioni del Forum europeo sugli aPL. Tutti i sieri sono stati testati anche per LA seguendo le linee guida aggiornate utilizzando il tempo di veleno di vipera Russell ed il tempo di protrombina parziale attivata, entrambi con fosfolipidi diluiti, come tests di screening. Risultati e Conclusioni. (1) Confronto ELISA home made con FEIA. Le sensibilita'  delle tecniche ELISA home made e FEIA sono risultate essere simili ad eccezione degli aCL di classe IgM che sono risultati significativamente piu' frequenti nei pazienti PAPS con il metodo ELISA. I due metodi avevano una specificita' simile, un'elevata concordanza e una correlazione significativa tra i livelli anticorpali. Inoltre il metodo FEIA non ha rilevato alcuna significativa prevalenza degli anticorpi antifosfolipidi nei pazienti ELISA negativi, ma con manifestazioni cliniche di APS. In conclusione, questi risultati suggeriscono che il metodo FEIA e' paragonabile al test ELISA home made. Se confermato da altri studi su ampie casistiche di pazienti affetti da PAPS, questi risultati potrebbero supportare l'uso del FEIA nella determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI nell'analisi di routine. Risultati e Conclusioni. (2) Confronto ELISA home made con CLIA. Quando e' stata confrontata la tecnica ELISA home made con la tecnica CLIA, e' emerso che il metodo CLIA aveva una sensibilita' significativamente piu' bassa per gli aCL IgM e gli anti-Beta2GPI IgG/IgM rispetto a quella dell'ELISA; invece la sua specificita' e' risultata significativamente piu' alta per gli anticorpi aCL IgM e anti-Beta2GPI IgM. Le due tecniche hanno mostrato un'alta e significativa concordanza e una significativa correlazione dei titoli anticorpali. Inoltre il CLIA ha rilevato gli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi in ELISA. Vi era infatti una prevalenza di aCL IgG e di anti-Beta2GPI IgG significativamente maggiore nei pazienti sieronegativi con i criteri clinici di APS che nella popolazione sana di controllo. In conclusione, il metodo CLIA, nonostante una minore sensibilita', ha mostrato una specificita' piu' alta per alcuni aPL e un buon livello di concordanza e di correlazione con la metodica ELISA home made. Il CLIA, inoltre, e' stato in grado di rilevare gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi non identificati dall'ELISA. Se confermato da ulteriori studi, il CLIA potrebbe essere considerato un metodo valido per la valutazione di pazienti con manifestazioni cliniche di APS, ma con gli aPL negativi al test ELISA home made. Risultati e Conclusioni. (3) Gli aCl e gli anti-Beta2GPI di classe IgA: Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgA sono stati testati con il metodo FEIA e sono risultati sgnificativamente presenti rispettivamente nel 19% e nel 50% dei pazienti affetti da PAPS. I loro titoli medi erano piu' elevati nei pazienti con impegno trombotico rispetto alle pazienti con impegno ostetrico. Tuttavia solo gli anti-Beta2GPI IgA erano significativamente associati alla trombosi. Quando sono stati analizzati i pazienti FEIA negativi per aCL IgG/IgM e per anti-Beta2GPI IgG/IgM ma con le caratteristiche cliniche di APS, nel 10,6% di essi sono stati trovati gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA. Questo dato e' risultato essere significativo nel confronto con la popolazione sana di controllo. In conclusione, la positivita' per gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA definita con il metodo FEIA e' risultata clinicamente rilevante nei pazienti PAPS. Inoltre la presenza di anticorpi anti-Beta2GPI IgA era significativa nei pazienti sieronegativi per gli isotipi IgG e IgM. Questi risultati suggeriscono che nei pazienti con segni/sintomi clinici di APS, ma che non soddisfano i criteri di laboratorio per gli anticorpi antifosfolipidi convenzionali si potrebbero determinare gli anticorpi anti-Beta2GPI di classe IgA al fine di incrementare la sensibilita'  diagnostica per APS. Risultati e Conclusioni. (4) Gli anti-DI IgG: La sensibilita' e la specificita' degli anticorpi anti-DI IgG rilevati con il metodo CLIA erano paragonabili a quelle degli anticorpi aCL IgG e anti-Beta2GPI IgG. Si e' riscontrata una significativa concordanza, un'associazione e una correlazione dei titoli anticorpali degli anti-DI IgG con gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG. Inoltre gli anticorpi anti-DI IgG hanno mostrato una minore prevalenza e titoli medi piu' bassi nelle complicanze ostetriche rispetto ai pazienti con trombosi e ai pazienti con entrambi i coinvolgimenti clinici. Per quanto riguarda i profili anticorpali degli aPL convenzionali, il gruppo con la triplice positivita' antifosfolipidica ha mostrato una maggiore prevalenza e maggior titoli medi degli anticorpi anti-DI, rispetto ai gruppi con singola e duplice positivita'. In conclusione, gli anti-DI, rilevati con la tecnica CLIA, possono essere considerati dei promettenti biomarkers per la valutazione del rischio clinico di trombosi vascolare e di triplice positivita' per gli aPL convenzionali, solitamente associata ai quadri clinici piu' severi di APS. Pertanto, essi possono costituire uno strumento aggiuntivo utile per eventuali decisioni cliniche e terapeutiche.
28-dic-2015
Background. Antiphospholipid (aPL) antibodies are a heterogeneous group of autoantibodies directed against plasma protein-phospholipid complexes or single plasma proteins. Their presence in patients with thrombosis and/or pregnancy morbidity defines antiphospholipid syndrome (APS). APS is considered as primary (PAPS) if present alone, or secondary if associated with other systemic autoimmune diseases, particularly with systemic lupus erythematosus (SLE). Laboratory criteria for APS classification include lupus anticoagulant (LA) and/or medium-high levels of IgG/IgM anticardiolipin (aCL) and/or medium-high levels of IgG/IgM anti-Beta2glycoprotein I (anti-Beta2GPI) antibodies, all confirmed no earlier than 12 weeks later. Currently, ELISA assay for detection of aCL and anti-Beta2GPI antibodies, despite several attempts, is not a standardized technique. Recently, few studies have compared the performance of ELISA with that of other technologies also fully automated including the fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) and the chemiluminescence immunoassays (CLIA), but they have produced debatable results. The search for new markers of APS through the use of laboratory techniques alternatives to ELISA, such as FEIA and CLIA methods is currently under interest. IgA aCL and IgA anti-Beta2GPI antibodies are not considered one of the recommended laboratory criteria for APS classification, and their clinical relevance is as yet controversial. Moreover, aPL are not only considered as a tool for APS classification, but they could be useful parameters to stratify the risk for developing clinical manifestations of the disease. In particular, anti-anti-Beta2GPI antibodies directed against the Domain I (anti-DI) of the molecule, were reported to be associated to thrombotic risk in antiphospholipid syndrome (APS), so correlating them with a more severe clinical picture. Objectives. The aim of the study was to compare the performance of a home-made ELISA with that of FEIA and CLIA assays in detecting aCL and anti-Beta2GPI antibodies in a large, homogeneous cohort of PAPS patients and in a group of subjects with clinical criteria for APS classification but ELISA negative for laboratory criteria. The results were compared with those obtained in a control group including healthy blood donors and patients with autoimmune diseases different from APS. Subsequently, the clinical relevance of IgA aCL, IgA anti- Beta2GPI antibodies and of IgG anti-DI antibodies was evaluated in a large homogeneous cohort of PAPS patients. Their diagnostic sensitivity was investigated in a group of seronegative patients for conventional aPL but with clinical manifestations of APS. Moreover, prognostic value of these antibodies in APS patients was studied. Methods. IgG/IgM/IgA aCL and IgG/IgM/IgA anti-Beta2GPI antibodies were determined using FEIA, (EliA TM, Phadia AB, Sweden). aCL/anti-Beta2GPI of IgG isotype and IgG anti-DI antibodies were assayed using CLIA (HemosIL AcuStar®, Inova, USA). The manufacturer's recommendations were followed carefully for both techniques. A home-made ELISA performed following the European Forum on aPL recommendations was used for the comparison between methods. All sera were also tested for LA following updated guidelines using diluted Russell viper venom time and diluted activated partial thromboplastin time as screening tests. Results and Conclusions. (1) Comparison between an ELISA home made and FEIA technique. The sensitivities of the ELISA and FEIA tecniques were similar with the exception of IgM aCL which was found to be significantly higher in the PAPS patients using the ELISA method. The two assays had a comparable specificity, a high significant agreement and a significant correlation between the antibody levels. FEIA testing uncovered no significant prevalence of any antiphospholipid antibody in the ELISA negative patients. In conclusion, our results suggest that FEIA tecnique is comparable to a home-made ELISA. If confirmed by large scale studies on PAPS patients, these results could support FEIA's routine use in detecting aCL and anti-Beta2GPI antibodies. Results and Conclusions. (2) Comparison between an ELISA home made and CLIA technique. When compared with the ELISA technique, it came to light that the CLIA method had a significantly lower sensitivity for IgM aCL and IgG/IgM anti-Beta2GPI antibodies; while, its specificity was higher with respect to ELISA for IgM aCL and IgM anti-Beta2GPI antibodies. The two techniques showed a high, significant agreement and a significant antibody titer correlation. CLIA also detected IgG/IgM aCL and IgG anti-Beta2GPI antibodies in the seronegative patients using ELISA method. There was a significantly higher prevalence of IgG aCL and IgG anti- Beta2GPI antibodies in those patients with respect to that in the control population. In conclusion, despite a lower sensitivity, CLIA showed a higher specificity for some aPL and a good level of agreement and correlation with a home made ELISA. CLIA also detected some aCL and anti-Beta2GPI antibodies in the seronegative patients not usually identified by home made ELISA. If confirmed by further studies, CLIA could be considered a valuable method to assess patients with clinical manifestations of APS but testing negative for aPL using a home made ELISA. Results and Conclusions. (3) ACL and anti-Beta2GPI antibodies of IgA isotype. Present respectively in 19% and 50% of the PAPS patients studied, IgA aCL and IgA anti- Beta2GPI antibody frequencies were both statistically significant .The mean titers of both IgA aCL and IgA anti-Beta2GPI antibodies were higher in the thrombotic patients, but only the latter were significantly associated with thrombosis. When analyzed, the patients FEIA negative for conventional IgG/IgM aPL, but with the clinical features of APS, in 10.6% of cases were tested positive for anti-Beta2GPI IgA, this data was found to be significant. In conclusion, positivity to IgA anti-Beta2GPI antibody detected using FEIA was found to be clinically relevant in PAPS patients. Moreover, the prevalence of isolated IgA anti- Beta2GPI antibody positivity was significant in the seronegative patients. These results suggest that patients with clinical signs/symptoms of APS but who do not meet conventional antiphospholipid antibody laboratory criteria could undergo at least of IgA anti-Beta2GPI antibody testing using FEIA technique. Results and Conclusions. (4) IgG anti-DI antibodies. The sensitivity and specificity of IgG anti-DI antibodies were comparable to those of IgG aCL and IgG anti-Beta2GPI antibodies. There was a significant agreement, association and antibody titre correlation between IgG anti-DI and IgG aCL as well as IgG anti-Beta2GPI antibodies. IgG anti-DI antibody showed lesser prevalence and mean titres in the pregnancy morbidity than in thrombotic and PAPS patients with both involvements. Regarding the conventional aPL antibody profiles, the triple positivity group had higher prevalence and mean titres than single and double positivity ones. In conclusion, as regards the anti-DI antibodies this study provides further evidence that these antibodies detected by CLIA, can be considered a promising biomarker for risk assessment particularly in patients having vascular thrombosis and triple conventional aPL positivity, which is considered an antibody profile associated to the most severe features of APS. Thus, anti-DI antibodies might constitute an additional useful tool in clinical and therapeutic decisions.
Sindrome da anticorpi antifosfolipidi; FEIA; CLIA, anticardiolipina IgA; anti-Beta2 Glicoproteina I IgA; anti Dominio I IgG/Antiphospholipid Syndrom; FEIA; CLIA; IgA anticardiolipin; IgA anti-Beta2 Glycoprotein I; IgG anti Domain I
Contributo alla determinazione degli anticorpi anticardiolipina e anti - beta2 glicoproteina I / Mattia, Elena. - (2015 Dec 28).
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