Molecular bases of phenotypic and clinical variability in Duchenne and Becker muscular dystrophy

Dystrophinopathies are a group of X-linked recessive neuromuscular disorders due to mutations in the DMD gene. Truncating mutations, causing dystrophin absence in skeletal and cardiac muscle, cause the more severe form of dystrophinopathy, Duchenne muscular dystrophy (DMD). Conversely, mutations which respect the open reading frame, and give rise to quantitatively or qualitatively altered dystrophin, cause the milder allelic variant known as Becker muscular dystrophy (BMD). DMD is a devastating disorder. Progressive muscle wasting and weakness causes disability since childhood, and the natural history is characterized by loss of independent ambulation (LoA) around 10 - 15 years of age, and reduced life expectancy because of respiratory and cardiac complications in young adults. Glucocorticoid corticosteroids (GCs) might delay disease progression, and there are promising novel molecular treatments, but a definitive cure remains elusive. Promising molecular treatments include antisense oligonucleotides (AONs) inducing exon skipping in out-of-frame deletions and premature stop codon readthrough compounds. There is relevant variability in the severity and rate of progression of muscle wasting and weakness in DMD, which is not explained, if not in a minor proportion, by the disease-causing mutation, as all DMD patients have a complete, or near to complete dystrophin defect. Recently, our group and other authors have described genetic modifiers of DMD, i.e. common single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated to more or less severe DMD expressivity. These include rs28357094, a SNP in the promoter of the SPP1 gene, enconding the cytokine osteopontin, and a coding haplotype in the LTBP4 gene, enconding Latent Transforming growth factor β-Binding Protein 4. These variants modulate the expression (SPP1), or alter the aminoacid sequence (for LTBP4) of corresponding proteins, both of which are involved in inflammatory and pro-fibrotic pathways. They were both identified by candidate gene approaches (respectively, expression profiling studies and a murine genome scan). The first aim of this thesis was to provide an independent validation of the genetic association of the SPP1 rs28357094 SNP and the LTBP4 haplotype with age at LoA in DMD. This was achieved using data from the Cooperative International Neuromuscular Research Group Duchenne Natural History Study (CINRG-DNHS) of 340 DMD patients from 20 worldwide Centers. In this population, the minor allele G at rs28357094 was associated to a 2-year delay of LoA in CINRG-DNHS participants who had been treated with glucocorticoids (p < 0.05), and no significant effect in untreated patients, suggesting that the SNP might be a pharmacodynamic biomarker of GC response. Furthermore, the homozygous LTBP4 haplotype “IAAM” was associated to a 2-year delay of LoA in participants of European descent (p < 0.05), but not in the whole multi-ethinc CINRG-DNHS cohort, highlighting the relevance of population stratification in genetic modifier studies. The second aim was to test for associations between specific DMD mutations and age at LoA in the CINRG-DNHS. We confirmed previous reports that deletions bordering exon 44 (and thus amenable to AON treatment for skipping of this exon), as well as the deletion of exons 3-7, were associated to later LoA (p < 0.01 and < 0.05 respectively). These findings have repercussions on clinical trial design and prognosis. A third aim was to study age at LoA as a long-term outcome of several different GC regimens currently adopted in DMD. In this observational study, we found that the use of daily deflazacort was associated to 2.7-year later LoA than daily prednisone (p < 0.001), an unexpected finding that may be confirmed by ongoing randomized trials. As a fourth aim, we genotyped 175/340 CINRG-DNHS participants with an Exome Chip, including thousands of functional (regulatory or coding) variants, and performed a genome-wide association study (GWAS) of age at LoA in a subgroup of 109 unrelated participants of European ancestry. While no SNP surpassed the Bonferroni-corrected significance threshold, we performed a hypothesis-driven prioritization of findings, focused on inflammatory and pro-fibrotic pathways, and identified a hit in a gene involved in inflammation and cell-mediated immunity. The GWAS association of earlier LoA with the minor allele at the identified locus (p < 9.9*10-5) was validated in a collaborative cohort of 660 DMD patients from the University of Padova, the European Bio-NMD network, and the United Dystrophinopathy Project in the USA (p < 0.05). Finally, the fifth aim focused on BMD, which features a milder, but even more variable clinical picture than DMD. In BMD, most patients have in-frame deletions leading to internally deleted dystrophin protein. We quantified dystrophin by Western Blot, performed a retrospective study of LoA and loss of the ability to run, and a 1-year longitudinal study of motor function (6 Minute Walk Test [6MWT], North Star Ambulatory Assessment [NSAA], timed function tests [TFTs]) in 69 BMD patients at the University of Padova. We found that deletions bordering exon 45 were associated with frequent loss of the ability to run, risk of LoA in adults, and overt muscle weakness; while some deletion groups, like those bordering exon 51, or limited to exon 48, were preserved from these signs of disease progression. This is relevant not only to BMD prognosis and genetic counseling, but also to outcomes of exon skipping AON treatments which aim to reproduce the same deletions at the transcript level in DMD. Furthermore, we observed that NSAA and 6MWT, which we mutuated from DMD studies and had not been applied to BMD, were feasible, clinically meaningful, and able to identify disease progression at 1 year, suggesting their adequacy as outcome measure for future BMD clinical trials. Altogether, the work presented here provides novel insights into the mechanisms of phenotypic and clinical variability in dystrophinopathy, which will be useful in delivering improved care for these disabling diseases.

Le distrofinopatie sono un gruppo di malattie legate al cromosoma X in modalità recessiva, dovute a mutazioni nel gene DMD. La forma più severa, la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), è causata da mutazioni troncanti, che provocano una completa assenza della proteina distrofina nel muscolo scheletrico e cardiaco. Al contrario, la forma allelica più mite, nota come distrofia muscolare di Becker (BMD), è causata da mutazioni che rispettano la cornice di lettura del gene, dando origine a distrofina quantitativamente e/o qualitativamente alterata. La DMD è una malattia devastante, caratterizzata da una progressiva degenerazione del tessuto muscolare, con deficit di forza e disabilità sin dall'infanzia. La storia naturale è caratterizzata da perdita della deambulazione autonoma attorno all'età di 10 - 15 anni, e da ridotta aspettativa di vita a causa di complicanze respiratorie e cardiache nei giovani adulti. I glucocorticoidi (GC) possono ritardare la progressione della malattia, ma una cura definitiva non è ancora disponibile. Fra i trattamenti molecolari innovativi più promettenti, annoveriamo gli oligonucleotidi antisenso (AON) che inducono l’“exon skipping” di specifici esoni nelle mutazioni “out-of-frame”, e i composti che inducono il “readthrough” dei codoni di stop prematuri. Vi è una rilevante variabilità nella severità e velocità di progressione del deficit di forza e della degenerazione del tessuto muscolare nella DMD, che non si spiega, se non in piccola parte, in base alle diverse mutazioni patogenetiche, dal momento che tutti i pazienti presentano una completa o quasi completa assenza di distrofina. Recentemente, il nostro gruppo e altri autori hanno descritto modificatori genetici della DMD, cioè polimorfismi di singolo nucleotide (SNP) associati a espressività più o meno severa del fenotipo DMD: lo SNP rs28357094 nel promotere del gene SPP1, codificante per la citochina osteopontina, e un aplotipo codificante nel gene LTBP4 (Transforming growth factor β-Binding Protein 4). Queste varianti modulano l’espressione (SPP1) o alterano la sequenza aminoacidica (LTBP4) delle rispettive proteine, entrambe le quali sono coinvolte in vie di segnale pro-infiammatorie e pro-fibrotiche. Questi geni sono stati identificati come modificatori candidati con approcci diversi (rispettivamente, studi di profili di espressione e mappatura genomica di un modello murino). Il primo obiettivo di questa tesi è stato di ottenere una validazione indipendente dell’associazione genetica dello SNP rs28357094 nel gene SPP1 e dell'aplotipo LTBP4 con l’età di perdita della deambulazione nella DMD. Questo risultato è stato conseguito utilizzando dati raccolti nel Duchenne Natural History Study del Cooperative International Neuromuscular Research Group (CINRG-DNHS), condotto su 340 pazienti DMD in 20 Centri in tutto il mondo. In questa coorte, l’allele minore G dello SNP rs28357094 era associato a un prolungamento della deambulazione di 2 anni nei partecipanti al CINRG-DNHS che erano stati trattati con GC (p < 0.05), ma a nessun effetto nei partecipanti non trattati. Ciò suggerisce che questo SNP potrebbe essere un biomarcatore farmacodinamico di risposta ai GC. L'aplotipo omozigote “IAAM” di LTBP4, invece, era associato a un prolungamento della deambulazione di 2 anni nei partecipanti di origine europea (p < 0.05), ma non nell'intera coorte multietnica CINRG-DNHS, evidenziando la rilevanza della stratificazione di popolazione negli studi sui modificatori genetici. Il secondo obiettivo è stato rivolto alla identificazione di eventuali associazioni fra specifiche mutazioni DMD e perdita della deambulazione nel CINRG-DNHS. Le delezioni confinanti con l’esone 44 (e quindi eleggibili per trattamento con AON che provocano lo “skipping” di questo esone) erano associate a perdita della deambulazione più tardiva, così come la delezione degli esoni dal 3 al 7 (rispettivamente p < 0.01 e < 0.05). Questi risultati potranno avere ripercussioni rilevanti sulla prognosi e sulla progettazione di trial clinici. Come terzo obiettivo, abbiamo studiato l’età alla perdita della deambulazione come esito a lungo termine di diversi regimi di GC attualmente utilizzati nella DMD. In questo studio osservazionale, abbiamo osservato che l’uso del deflazacort quotidiano era associato perdita della deambulazione più tardiva di 2.7 anni rispetto al prednisone quotidiano (p < 0.001), un risultato inaspettato che potrebbe essere confermato da studi clinici randomizzati attualmente in corso. Come quarto obiettivo, abbiamo genotipizzato 175/340 partecipanti al CINRG-DNHS con Exome Chip, un chip di genotipizzazione che include migliaia di varianti funzionali (regolatorie e codificanti), e abbiamo condotto un “genome-wide association study” (GWAS) del fenotipo :età alla perdita della deambulazione in un sottogruppo di 109 pazienti di origine europea (o europea-americana) non imparentati fra loro. Dal momento che nessuno SNP sorpassava la soglia di significatività corretta per test multipli secondo Bonferroni, abbiamo priorizzato i risultati focalizzandoci sui geni coinvolti in vie di segnale pro-infiammatorie e pro-fibrotiche. Abbiamo identificato così uno SNP in un gene coinvolto nell'infiammazione e nell'immunità cellulo-mediata. L’associazione dell’allele minore al locus identificato con una più precoce perdita della deambulazione (p < 9.9*10-5) è stata successivamente validata in una coorte collaborativa di 660 pazienti DMD raccolta presso l’Università di Padova, il network Bio-NMD, e il network statunitense United Dystrophinopaty Project (p < 0.05). Infine, il quinto obiettivo si è rivolto alla BMD, che presenta un quadro clinico più mite, ma anche più variabile rispetto alla DMD. La maggioranza dei pazienti BMD ha delezioni che rispettano la cornice di lettura con espressione di distrofina internamente deleta. Abbiamo quantificato la distrofina tramite Western Blot, e condotto uno studio retrospettivo della perdita della deambulazione e della capacità di correre, e uno studio longitudinale di 1 anno delle funzioni motorie (“6 Minute Walk Test” [6MWT], “North Star Ambulatory Assessment” [NSAA] e “timed function tests” [TFTs]) in 69 pazienti BMD seguiti presso l’Università di Padova. Abbiamo osservato che le delezioni che terminano sull'esone 45 presentavano frequente perdita della capacità di correre, occasionale perdita della deambulazione e un franco deficit di forza, mentre altri gruppi di delezioni, come quelle che terminano sull'esone 51, o limitate al solo esone 48, presentavano una funzione muscolare migliore. Questi risultati sono rilevanti non solo per la prognosi e la consulenza genetica nella BMD, ma consentono anche di poter predire un possibile esito della terapia con AON per la DMD. Gli AON mirano infatti a riprodurre a livello di trascritto le medesime delezioni osservate nei pazienti BMD. Inoltre, abbiamo osservato che le misure funzionali 6MWT e NSAA, mutuate da studi sulla DMD e non ancora utilizzate nella BMD, sono di semplice applicazione, clinicamente rilevanti, e in grado di identificare la progressione di malattia a un anno. Questi risultati suggeriscono che esse siano appropriate misure di esito funzionale in futuri studi clinici. Complessivamente, i lavori qui presentati offrono nuove prospettive sui meccanismi di variabilità fenotipica e clinica nelle distrofinopatie, che risulteranno utili per offrire cure migliori ai pazienti affetti da queste malattie disabilitanti.