COVERT HEPATIC ENCEPHALOPATHY: DIAGNOSIS, REVERSIBILITY AFTER LIVER TRANSPLANT AND ROLE OF GUT MICROBIOTA

Background. Hepatic encephalopathy (HE) produces a wide spectrum of nonspecific neurological and psychiatric manifestations. Mild HE that does not produce disorienting in time/space or asterixis is called covert HE (CHE). It occurs in 20%–80% of patients with cirrhosis. While significant progress has been made in understanding the importance of CHE, to date there is no consensus guidelines regarding the screening procedures for CHE and all the recognized techniques, although more or less sensitive and objective, require some kinds of equipment. Furthermore, the diagnosis of CHE can be confounded by other factors (as chronic alcohol misuse or HCV infection), which can cause cognitive alterations. It is also important to identify CHE in patients awaiting liver transplantation (LT) for the proper interpretation of cognitive disorders that may occure after transplantation. Infact, the influence of LT on mental performance is debated; as is the role of pretransplant HE. Notable, recent data on LT suggest that the cognitive dysfunction may not be totally reversible. Another important issue regards the treatment of CHE, in particular the effect of treatments on gut microorganism and ammonia production by microbial activity. HE treatment with prebiotics, antibiotics and probiotics, generally evidences a reduction of photogenic/ ammoniagenic bacteria and an increase in neurocognitive tests and mental status in patients. Nevertheless from a strictly microbiological point of view, little is known about the dynamics, interaction and metabolite production of the main bacterial groups in liver diseases. Aims. The present study aims to: 1) test a simple verbal psychometric test, called Animal Naming Test (ANT1), in the detection of CHE; 2) to evaluate the role of alcohol misuse, HCV infections, diabetes, aging and level of education as potential confounding factors in the diagnosis of CHE; 3) to evaluate the time course of the neuropsychological and electroencephalogram (EEG) features of patients with cirrhosis before and after LT with respect to prior HE and 4) to investigate how the HE treatments (by the use of lactulose, rifaximin and a probiotc mixture) affects gut microbial composition, determining changes in ammonia production. Materials and methods. For Aim 1: 208 healthy subjects and 327 consecutive patients with cirrhosis underwent the ANT1. Patients with cirrhosis were assessed by the Psychometric Hepatic Encephalopathy Score (PHES), a subgroup of 146 underwent also a quantified EEG and 95 the Critical Flicker Frequency. 202 patients were followed up for the occurrence of overt HE (OHE) and death. For Aim 2: a comprehensive neuropsychological profile and EEG spectral parameters were obtained in six age-matched groups of 30 subjects each: (i) HCV-related hepatitis without cirrhosis, (ii) chronic alcohol abusers, (iii) patients with HCV-related cirrhosis, (iv) alcohol-related cirrhosis, (v) cirrhosis not related to alcohol or HCV and (vi) healthy subjects. Cirrhotic patients were matched for MELD score. For Aim 3: the study population included 65 patients with cirrhosis on the transplant waiting list; 23 had a history of OHE. Each patient underwent an extensive psychometric assessment (10 tests, including paper and pencil tests and a computerized test) and an EEG before and 9 to 12 months after LT. EEGs were analyzed spectrally, and the mean dominant frequencies were obtained. For Aim 4: independent batch culture fermentations with controlled pH (6.8) were inoculated with fecal samples from six patients with cirrhosis (age 66±3.3 years; Child-Pugh A n=5 and B n=1); average MELD score 9±2.8). Seven different treatments with lactulose, rifaximin and VSL#3 or their combination were performed. Microbial populations were enumerated using flow cytometry Fluorescent in Situ Hybridization, while an ammonia concentration was determined at 0, 4, 10 and 24 hours. Results. Aim 1: in controls, the ANT1 was found relevantly affected only by extremely low levels of education (<8 yrs) and old age (>80 yrs; p<0.001). Thus, an age and education adjusted criterion was obtained (S-ANT1). Patients with CHE had significantly lower S-ANT1 than the unimpaired ones (12±0.4 vs 16±0.7; p<0.001). By ROC analysis, two thresholds of 10 and 15 animals were obtained, producing a Scoring System (0=S-ANT1>15, 1=S-ANT1 10-15, 2=S-ANT1<10 sensitivity 83%, specificity 84%, respectively vs. PHES) that was correlated both to PHES (p<0.0001) and EEG (p=0.007). In the follow up, the S-ANT1 resulted to have prognostic value on the risk of OHE and death, so that a prognostic index could be computed. Aim 2: the factor ‘cirrhosis’ was associated with low Phonemic Verbal Fluency (PVF) and Difference between Trail Making Test B and A (TMT B-A) (p<0.001). Chronic alcohol misuse was associated with low PVF, TMT (B-A), Memory with Interference Task at 10 (ITM 10) and 30s (ITM 30) (all p<0.05). An interaction was found between the factors ‘cirrhosis’, ‘alcohol misuse’ and tests (p<0.01). HCV hepatitis reduced ITM 10 (p<0.05), but no interaction was found between ‘cirrhosis’, ‘HCV infection’ and tests (p= 0.14). The EEG parameters were mainly influenced by ‘cirrhosis’ (p<0.05), and EEG alterations were more pronounced in patients with alcoholic cirrhosis (p=0.04). Aim 3: Patients with a history of OHE before LT had worse cognitive performances (p<0.001) and EEG performances in comparison with their counterparts with a negative history. They also showed greater cognitive improvement after LT (p<0.01); however, their global cognitive performance remained slightly impaired (p <0.01). After LT, EEGs normalized for 98% of the patients (p <0.01), regardless of any history of OHE. Aim 4: Lactulose treatment significantly increased total bacteria, Bifidobacteria and Fecalibacterium prausnitzii after 5 hours (p≤0.05); in contrast Rifaximin and a probiotic mixture (VSL#3) have no significant effect. After 24 hours the combination of lactulose/Rifaximine/VSL#3 significantly increased total bacteria and Bifidobacteria. At time 5 h, lactulose significanly reduced ammonia, whereas rifaximin had no significant effect. VSL#3 alone had never significant affect in reducing ammonia, whereas at 24 h, in combination with lactulose and rifaximin, reduced significantly ammonia. Conclusions. The ANT1 is an easy first-line measure useful for detection of CHE. The diagnosis of CHE should considered the concomitant presence of alcohol misuse and low educational level, which had a synergistic effect with cirrhosis in damaging cognitive functions, and thus they should be considered as possible confounders when testing for CHE. After LT, patients with a history of HE showed greater improvements than patients with a negative history, but their global cognitive function remained slightly worse; in contrast, EEGs normalized in both groups. Regarding HE treatments, microbial modulation by prebiotic, antibiotic and probiotic differently affect the population dynamics and metabolism. The strong increase in beneficial bacteria, reduction of ammonia and regulation of metabolite production seen using lactulose and its combination with VSL#3, emphasize the importance of gut microbiota handling in HE treatment.

Stato dell’arte. L’encefalopatia epatica (EE) è caratterizzata da un ampio spettro di manifestazioni aspecifiche, sia neurologiche che psichiatriche. Un EE lieve tale da non indurre disorientamento spazio-temporale o asterissi è definita “EE non conclamata”, e si manifesta nel 20%-80% dei pazienti con cirrosi epatica. Sebbene siano stati compiuti notevoli progressi nella comprensione dell'importanza dell’EE non conclamata, non esistono, ad oggi, linee guida condivise in materia di screening. Inoltre, tutte le tecniche di diagnosi universalmente riconosciute, anche se più o meno sensibili ed obiettive, richiedono l’utilizzo di una qualche forma di strumentazione. La diagnosi di CHE dovrebbe anche tener conto di altri fattori (come l’abuso alcolico o l’infezione da virus C), in grado di per sé di causare alterazioni cognitive, che potrebbero agire da fattori di confondimento. Un’altra problematica aperta in ambito di EE non conclamata è la reversibilità delle alterazioni cognitive, caratteristiche dei pazienti con storia di EE, dopo trapianto di fegato che è tuttora controversa. Studi recenti sembrano suggerire che le alterazioni cognitive caratteristiche dei pazienti con storia di EE non siano completamente reversibili. Anche il ruolo del microbiota intestinale nella patogenesi e quindi nella terapia dell’EE non è del tutto noto. Studi recenti hanno dimostrato che le terapie dell’EE, che si basano su prebiotici, antibiotici e probiotici, determinano una riduzione di batteri ammoniagenici e un concomitante miglioramento dei test neurocognitivi e dello stato mentale dei pazienti. Tuttavia, da un punto strettamente di vista microbiologico, poco si conosce circa le dinamiche e l'interazione tra i principali gruppi di batteri e come si modifica la produzione di ammonio a seguito della somministrazione di tali terapie. Scopi dello studio. Il presente studio si propone di: 1) testare un test psicometrico verbale, chiamato Animal Naming Test (ANT1), nella diagnosi di EE non conclamata; 2) valutare il ruolo dell’abuso alcolico cronico, dell’infezione da virus, del diabete, dell’invecchiamento e del livello d’istruzione come potenziali fattori di confondimento nella diagnosi di EE non conclamata; 3) di valutare l'andamento temporale neuropsicologico ed elettroencefalografico dei pazienti con cirrosi prima e dopo trapianto di fegato, in relazione alla presenza o meno di una storia di EE prima del trapianto e 4) di valutare come i trattamenti dell’EE (quali il lattulosio, la rifaximina e il probiotico VSL#3) modifichino la composizione microbica intestinale e determinino cambiamenti nei livelli di ammonio. Risultati. Obiettivo 1: nei controlli l’ANT1 è risultato influenzato in modo significativo solo da livelli di istruzione estremamente bassi (<8 anni di scolarità) e da un’età molto avanzata(> 80 anni; p<0,001). Sono, quindi, stati calcolati i punteggi aggiustati per età e livello d’istruzione (S-ANT1). I pazienti cirrotici con EE non conclamata avevano uno S-ANT1 significativamente inferiore dei pazienti senza EE (12±0,4 vs 16±0,7; p<0.001). L’analisi delle curve ROC ha permesso di ottenere due valori soglia dell’S-ANT1, di 10 e 15 animali/minuto, ed è stato costruito un sistema di Scoring (0=S-ANT1> 15, 1=S-ANT1 10-15, 2=S-ANT1<10 con sensibilità 83% e specificità 84%) che è risultato ben correlato sia con la PHES (p<0,0001) che con l’EEG (p=0.007). Nel follow-up, lo S-ANT1 è risultato avere un valore prognostico sia sul rischio di EE conclamata che sulla mortalità ad un anno. Obiettivo 2: il fattore 'cirrosi' è risultato associato sia con il Phonemic Verbal Fluency (PVF) che con la Differenza tra Trail Making Test B e A (TMT) (B-A) (p<0.001). L’abuso alcolico cronico è risulato associato con un bassi punteggi al PVF, al TMT (B-A) e ai test di Memoria di interferenza a 10 (ITM 10) e 30 s (ITM 30) (tutti p<0.05). E’ stata trovata un'interazione tra i fattori «cirrosi',' abuso alcolico 'e test (p<0,01). Il virus C determina una riduzione dell’ITM 10 (p<0,05), ma nessuna interazione è stata trovata tra i fattori 'cirrosi', 'infezione da HCV' e test (p=0.14). I parametri EEG sono risultati principalmente influenzati dal fattore 'cirrosi' (p<0,05). Obiettivo 3: i pazienti con una storia di EE, prima del trapianto, hanno avuto performance cognitive ed EEG peggiori rispetto alla controparte senza storia di EE (p<0.001). Ma, dopo il trapianto, hanno mostrato un miglioramento cognitivo maggiore (p<0.01); tuttavia, la loro performance cognitiva globale rimane lievemente compromessa (p<0,01). Dopo il trapianto, l’EEG si normalizza nel 98% dei pazienti (p<0.01), indipendentemente dall’avere una storia di EE. Obiettivo 4: il trattamento con lattulosio aumenta significativamente il numero totale dei batteri, dei Bifidobatteri e del Fecalibacterium prausnitzii, rispetto al controllo e dopo 5 ore (p≤0.05); al contrario sia Rifaximina che il probiotico VSL#3 non hanno alcun effetto significativo. Dopo 24 ore la combinazione di lattulosio/Rifaximina/VSL#3 aumenta significativamente il numero totale dei batteri e i bifidobatteri. Per quanto riduarda la produzione di ammonio, il lattulosio riduce in modo significativo l’ammonio, mentre la Rifaximina non ha effetti significativi. Il probiotico VSL#3 da solo non ha mai un effetto nel ridurre l’ammonio, mentre in combinazione con lattulosio e rifaximina a 24 ore lo riduce significativamente. Conclusioni. L’ANT1 è uno strumento utile e facile da somministrare per il rilievo dell’EE non conclamata. La diagnosi dell’EE non conclamata dovrebbe inoltre tener conto della concomitante presenza di un abuso cronico alcolico e di un basso livello d’istruzione, che possono avere un effetto sinergico con la cirrosi nell’alterare le funzioni cognitive, e dovrebbero quindi essere considerati come fattori di confondimento nella diagnosi di EE non conclamata. Dopo trapianto di fegato, i pazienti con una storia di EE prima del trapianto presentato nel post-trapianto un miglioramento maggiore rispetto pazienti senza storia di EE, ma la loro performance cognitiva globale rimane un po’ alterata; al contrario, l’EEG si normalizza in quasi tutti i pazienti. Per quanto riguarda l’influenza delle terapie dell’EE sul microbiota intestinale dei pazienti con cirrosi, i prebiotici, gli antibiotici e i probiotici influenzano in modo diverso la dinamica e il metabolismo delle popolazioni batteriche. Il forte aumento dei batteri benefici e la riduzione dell’ammonio favoriti dal lattulosio e dalla sua combinazione con rifaximina e VSL#3, sottolineano l'importanza della manipolazione della flora intestinale nel trattamento dell’encefalopatia epatica.