Glucocorticoids (GCs) are steroid hormones exerting several essential functions during embryo development and physiological processes in adult life. They bind to their specific receptor, which upon ligand binding migrates to the nucleus, dimerizes and binds to specific glucocorticoid responsive elements (GREs) on DNA, which regulate in a positive or negative (nGREs) way the transcription of target genes. Besides, glucocorticoid receptor can indirectly regulate gene transcription, by means of protein-protein interactions with other transcription factors. This thesis is focused on the transcriptional analysis of GCs activity in the zebrafish model organism. In the first part of my PhD, we set and validated a glucocorticoid responsive zebrafish transgenic line (ia20), in which the green fluorescent protein EGFP (Enhanced-GFP) is located downstream of nine tandem GRE repeats. Thus, this line enables us to follow in vivo GCs transcriptional activity, by means of fluorescence observation. Endogenous fluorescence is first ubiquitously detectable during somitogenesis, becoming then more localized in discrete sites during the first days of development, where it persists until adulthood. EGFP signal increases in a dose-dependent way in response to different DEX concentrations, while gr inactivation through antisense morpholino causes a strong fluorescence decrease and the loss of DEX responsiveness. To validate the ia20 line specificity, we exposed embryos to different steroids at the same concentration: we observed a signal increase only in response to GCs treatments, while fluorescence was not modified by mineralocorticoids, androgens and estrogens treatments. Besides, we collected larvae every 2 hours for 28 hours and demonstrated that the ia20 line is sensitive to the daily endogenous GCs concentration fluctuations due to the circadian rhythm. For all these features, we can consider the ia20 line a potent biosensor to analyze GCs activity from a spatio-temporal point of view. In the last part of this thesis, we put the ia20 line in grs357 mutant background. In these mutants, the transcriptional activity of the glucocorticoid receptor mediated by a direct DNA binding is missing because of a single amino acid substitution in the DNA binding domain. The receptor function not requiring a direct DNA binding is maintained in mutants. Indeed, the mutation is not lethal in homozygosis. This line was generated in order to characterize the possible cross-reactivity among different steroid hormones, since glucocorticoid, mineralocorticoid, androgen and progestin receptors share the ability to bind GREs (that for this reason are also called “Hormone Responsive Elements”, HREs). In the ia20 line in grs357 background we observed a clear fluorescence decrease and a complete loss of GCs responsiveness at 3 dpf (days post fertilization), even at high GCs concentrations, suggesting that, at least during early development, the ia20 line is able to respond only to GCs. We also observed a decrease of endogenous fluorescence intensity at later stages, at 21 dpf and in some tissues in adults (but the latter result derives from a preliminary experiment). Besides, preliminary experiments on adult fish suggest that liver and gut only respond to glucocorticoid receptor in the ia20 line, because these tissues do not show endogenous fluorescence and do not respond to DEX in mutant background. In gonads, instead, and although to lesser extent in muscle, we hypothesize that androgens and progestins receptors may contribute to GREs-mediated transcriptional activity.

I glucocorticoidi sono ormoni steroidei con un ruolo di fondamentale importanza durante lo sviluppo embrionale e in molti processi fisiologici durante tutta la vita. Svolgono la loro funzione legandosi al loro recettore che in risposta al legame migra nel nucleo, dimerizza e si lega a specifiche sequenze di DNA responsive ai glucocorticoidi (glucocorticoid responsive elements, GREs). In questo modo regolano positivamente o negativamente (nGREs) la trascrizione di geni bersaglio. Il recettore per i glucocorticoidi può inoltre regolare la trascrizione genica in modo indiretto, mediante interazioni proteina-proteina con altri fattori di trascrizione. Questo lavoro di tesi si è focalizzato sull’analisi trascrizionale dell’attività dei glucocorticoidi nell’organismo modello zebrafish. Durante la prima parte del percorso di dottorato è stata messa a punto e validata una linea transgenica di zebrafish (ia20) responsiva ai glucocorticoidi, nella quale la proteina fluorescente EGFP (Enhanced-GFP) si trova a valle di nove ripetizioni in tandem della sequenza GRE. Mediante l’osservazione della fluorescenza è quindi possibile monitorare in vivo l’attività trascrizionale dei glucocorticoidi. La fluorescenza endogena inizia ad essere apprezzabile a partire dalla somitogenesi ed è inizialmente ubiquitaria, per poi localizzarsi in siti discreti nei primi giorni di sviluppo dove rimane rilevabile anche in età adulta. In risposta al trattamento con diverse concentrazioni del glucocorticoide sintetico desametasone (DEX), il segnale della EGFP aumenta in modo dose-dipendente, mentre l’inattivazione del trascritto per il gr, ottenuta mediante l’iniezione di un morpholino antisenso, provoca una considerevole diminuzione del segnale e la mancata risposta al DEX. La specificità della linea è stata validata trattando gli embrioni con diversi steroidi alla stessa concentrazione: il segnale aumenta solo in risposta ai glucocorticoidi mentre rimane invariato nei trattamenti con mineralocorticoidi, androgeni ed estrogeni. Inoltre, un campionamento ogni 2 ore nell’arco di un periodo di tempo di 28 ore ha dimostrato che la linea transgenica ia20 è sensibile alle variazioni di concentrazione dei glucocorticoidi endogeni dovute al ritmo circadiano. Queste caratteristiche rendono la linea ia20 un efficace biosensore per analizzare l’attività dei glucocorticoidi in vivo dal punto di vista spaziale e temporale. Durante l’ultimo periodo di dottorato, la linea ia20 è stata messa in background mutante grs357. In questi mutanti, l’attività trascrizionale del recettore dei glucocorticoidi legata ad un’interazione diretta con il DNA viene persa a causa di una singola sostituzione amminoacidica a livello del dominio di legame al DNA. Vengono invece mantenute le altre funzioni di controllo della trascrizione del recettore. La linea è stata generata con lo scopo di caratterizzare l’eventuale presenza di cross-reattività da parte dei diversi ormoni steroidei, in quanto i recettori per i glucocorticoidi, mineralocorticoidi, androgeni e progestinici condividono la capacità di legarsi ai siti GRE (definiti per questo motivo anche “Hormone Responsive Elements”, HREs). Nella linea ia20 in background mutante abbiamo osservato una notevole riduzione nella fluorescenza endogena ed una totale perdita di responsività ai glucocorticoidi anche a concentrazioni elevate su embrioni di tre giorni. Questo risultato suggerisce la mancanza di cross-reattività fra i diversi ormoni steroidei nei primi giorni di sviluppo, e questo a causa della mancata espressione di alti livelli dei recettori degli altri ormoni steroidei. Per quanto riguarda gli stadi più avanzati, la diminuzione nella fluorescenza endogena nei mutanti è stata osservata anche a tre settimane e in alcuni tessuti dell’adulto, in un esperimento preliminare che dovrà essere in seguito approfondito. Esperimenti preliminari su pesci adulti suggeriscono inoltre che la fluorescenza osservata nella linea ia20 su fegato ed intestino derivi solo dall’attivazione del recettore dei glucocorticoidi, in quanto nel mutante questi tessuti non presentano alcun segnale di fluorescenza e non rispondono al trattamento con il DEX. Per quanto riguarda le gonadi, e in misura minore il tessuto muscolare, il segnale fluorescente presente negli esemplari mutanti e la mancata risposta al DEX, possono essere spiegati dall’attività trascrizionale determinata dai recettori per gli androgeni e i progestinici.

A spatio-temporal dissection of the transcriptional activity of glucocorticoids in zebrafish: a new transgenic line as a living biosensor model / Colletti, Elisa. - (2015 Jan 30).

A spatio-temporal dissection of the transcriptional activity of glucocorticoids in zebrafish: a new transgenic line as a living biosensor model.

Colletti, Elisa
2015

Abstract

I glucocorticoidi sono ormoni steroidei con un ruolo di fondamentale importanza durante lo sviluppo embrionale e in molti processi fisiologici durante tutta la vita. Svolgono la loro funzione legandosi al loro recettore che in risposta al legame migra nel nucleo, dimerizza e si lega a specifiche sequenze di DNA responsive ai glucocorticoidi (glucocorticoid responsive elements, GREs). In questo modo regolano positivamente o negativamente (nGREs) la trascrizione di geni bersaglio. Il recettore per i glucocorticoidi può inoltre regolare la trascrizione genica in modo indiretto, mediante interazioni proteina-proteina con altri fattori di trascrizione. Questo lavoro di tesi si è focalizzato sull’analisi trascrizionale dell’attività dei glucocorticoidi nell’organismo modello zebrafish. Durante la prima parte del percorso di dottorato è stata messa a punto e validata una linea transgenica di zebrafish (ia20) responsiva ai glucocorticoidi, nella quale la proteina fluorescente EGFP (Enhanced-GFP) si trova a valle di nove ripetizioni in tandem della sequenza GRE. Mediante l’osservazione della fluorescenza è quindi possibile monitorare in vivo l’attività trascrizionale dei glucocorticoidi. La fluorescenza endogena inizia ad essere apprezzabile a partire dalla somitogenesi ed è inizialmente ubiquitaria, per poi localizzarsi in siti discreti nei primi giorni di sviluppo dove rimane rilevabile anche in età adulta. In risposta al trattamento con diverse concentrazioni del glucocorticoide sintetico desametasone (DEX), il segnale della EGFP aumenta in modo dose-dipendente, mentre l’inattivazione del trascritto per il gr, ottenuta mediante l’iniezione di un morpholino antisenso, provoca una considerevole diminuzione del segnale e la mancata risposta al DEX. La specificità della linea è stata validata trattando gli embrioni con diversi steroidi alla stessa concentrazione: il segnale aumenta solo in risposta ai glucocorticoidi mentre rimane invariato nei trattamenti con mineralocorticoidi, androgeni ed estrogeni. Inoltre, un campionamento ogni 2 ore nell’arco di un periodo di tempo di 28 ore ha dimostrato che la linea transgenica ia20 è sensibile alle variazioni di concentrazione dei glucocorticoidi endogeni dovute al ritmo circadiano. Queste caratteristiche rendono la linea ia20 un efficace biosensore per analizzare l’attività dei glucocorticoidi in vivo dal punto di vista spaziale e temporale. Durante l’ultimo periodo di dottorato, la linea ia20 è stata messa in background mutante grs357. In questi mutanti, l’attività trascrizionale del recettore dei glucocorticoidi legata ad un’interazione diretta con il DNA viene persa a causa di una singola sostituzione amminoacidica a livello del dominio di legame al DNA. Vengono invece mantenute le altre funzioni di controllo della trascrizione del recettore. La linea è stata generata con lo scopo di caratterizzare l’eventuale presenza di cross-reattività da parte dei diversi ormoni steroidei, in quanto i recettori per i glucocorticoidi, mineralocorticoidi, androgeni e progestinici condividono la capacità di legarsi ai siti GRE (definiti per questo motivo anche “Hormone Responsive Elements”, HREs). Nella linea ia20 in background mutante abbiamo osservato una notevole riduzione nella fluorescenza endogena ed una totale perdita di responsività ai glucocorticoidi anche a concentrazioni elevate su embrioni di tre giorni. Questo risultato suggerisce la mancanza di cross-reattività fra i diversi ormoni steroidei nei primi giorni di sviluppo, e questo a causa della mancata espressione di alti livelli dei recettori degli altri ormoni steroidei. Per quanto riguarda gli stadi più avanzati, la diminuzione nella fluorescenza endogena nei mutanti è stata osservata anche a tre settimane e in alcuni tessuti dell’adulto, in un esperimento preliminare che dovrà essere in seguito approfondito. Esperimenti preliminari su pesci adulti suggeriscono inoltre che la fluorescenza osservata nella linea ia20 su fegato ed intestino derivi solo dall’attivazione del recettore dei glucocorticoidi, in quanto nel mutante questi tessuti non presentano alcun segnale di fluorescenza e non rispondono al trattamento con il DEX. Per quanto riguarda le gonadi, e in misura minore il tessuto muscolare, il segnale fluorescente presente negli esemplari mutanti e la mancata risposta al DEX, possono essere spiegati dall’attività trascrizionale determinata dai recettori per gli androgeni e i progestinici.
30-gen-2015
Glucocorticoids (GCs) are steroid hormones exerting several essential functions during embryo development and physiological processes in adult life. They bind to their specific receptor, which upon ligand binding migrates to the nucleus, dimerizes and binds to specific glucocorticoid responsive elements (GREs) on DNA, which regulate in a positive or negative (nGREs) way the transcription of target genes. Besides, glucocorticoid receptor can indirectly regulate gene transcription, by means of protein-protein interactions with other transcription factors. This thesis is focused on the transcriptional analysis of GCs activity in the zebrafish model organism. In the first part of my PhD, we set and validated a glucocorticoid responsive zebrafish transgenic line (ia20), in which the green fluorescent protein EGFP (Enhanced-GFP) is located downstream of nine tandem GRE repeats. Thus, this line enables us to follow in vivo GCs transcriptional activity, by means of fluorescence observation. Endogenous fluorescence is first ubiquitously detectable during somitogenesis, becoming then more localized in discrete sites during the first days of development, where it persists until adulthood. EGFP signal increases in a dose-dependent way in response to different DEX concentrations, while gr inactivation through antisense morpholino causes a strong fluorescence decrease and the loss of DEX responsiveness. To validate the ia20 line specificity, we exposed embryos to different steroids at the same concentration: we observed a signal increase only in response to GCs treatments, while fluorescence was not modified by mineralocorticoids, androgens and estrogens treatments. Besides, we collected larvae every 2 hours for 28 hours and demonstrated that the ia20 line is sensitive to the daily endogenous GCs concentration fluctuations due to the circadian rhythm. For all these features, we can consider the ia20 line a potent biosensor to analyze GCs activity from a spatio-temporal point of view. In the last part of this thesis, we put the ia20 line in grs357 mutant background. In these mutants, the transcriptional activity of the glucocorticoid receptor mediated by a direct DNA binding is missing because of a single amino acid substitution in the DNA binding domain. The receptor function not requiring a direct DNA binding is maintained in mutants. Indeed, the mutation is not lethal in homozygosis. This line was generated in order to characterize the possible cross-reactivity among different steroid hormones, since glucocorticoid, mineralocorticoid, androgen and progestin receptors share the ability to bind GREs (that for this reason are also called “Hormone Responsive Elements”, HREs). In the ia20 line in grs357 background we observed a clear fluorescence decrease and a complete loss of GCs responsiveness at 3 dpf (days post fertilization), even at high GCs concentrations, suggesting that, at least during early development, the ia20 line is able to respond only to GCs. We also observed a decrease of endogenous fluorescence intensity at later stages, at 21 dpf and in some tissues in adults (but the latter result derives from a preliminary experiment). Besides, preliminary experiments on adult fish suggest that liver and gut only respond to glucocorticoid receptor in the ia20 line, because these tissues do not show endogenous fluorescence and do not respond to DEX in mutant background. In gonads, instead, and although to lesser extent in muscle, we hypothesize that androgens and progestins receptors may contribute to GREs-mediated transcriptional activity.
Recettore dei glucocorticoidi/ glucocorticoid receptor; zebrafish; linea transgenica/transgenic line; reporter per i glucocorticoidi in vivo/in vivo glucocorticoids reporter
A spatio-temporal dissection of the transcriptional activity of glucocorticoids in zebrafish: a new transgenic line as a living biosensor model / Colletti, Elisa. - (2015 Jan 30).
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