Targeting immunosuppressive myeloid cells using nanocarriers to improve cancer immunotherapy

In the last decade, different cancer immunotherapy approaches have been proved to produce objective clinical responses and survival benefits in cancer patients who failed conventional treatment options. However, the efficacy of cancer immunotherapy is known to be limited by tumor-induced expansion of immunosuppressive and tumor-promoting immune populations, including cells of myeloid origin (such as tumor associated macrophages –TAMs-, and myeloid-derived suppressor cells –MDSCs-). The development of increasingly powerful and widely applicable immunotherapies is therefore dependent on the availability of supporting treatments able to reduce tumor-associated immunosuppression, with good efficacy and low toxicity. Drug delivery nanosystems have been shown to improve pharmacological proprieties of anti-cancer drugs by increasing drug half-life, enhancing accumulation into tumor tissues and reducing off-target toxicity. In addition, the use of RNA delivery nanosystems is currently being explored for the development of RNA intereference (RNAi)-based anti-cancer therapeutics.The use of drug and RNA delivery nanosystems to target tumor-associated immune cells, besides tumor cells, is a far less explored approach, which is currently showing promiseas tool to improve cancer immunotherapy. In the present work we investigated two different nanotechnology-based tools to modulate the presence and function of tumor-associated myeloid cells:a modified form of gemcitabine encapsulated into lipid nanocapsules (LNC-GemC12), and ployarginine-coated nanocapsules (PolyArgNCs) loaded with short hairpin (sh) RNAs, for in vivo RNAi-based gene silencing. LNC-GemC12 and free gemcitabine hydrochloride (GemHCl, the current standard gemcitabine formulation)were found to selectively deplete both splenic and tumor-infiltrating monocytic (M-) MDSCs, following administration at a very low drug dose to EG7-OVA tumor bearing mice. Remarkably, LNC-GemC12 administration was associated with a stronger and more durable reduction of tumor-infiltrating M-MDSCs as compared withGemHCl, which resulted in the attenuation of MDSC suppressive activity towards T cells. More importantly,treatment of EG7-OVA tumor bearing mice with LNC-GemC12,prior to adoptive cell transfer therapy (ACT) with OVA-specific T lymphocytes,significantly extended mouse survival as compared to mice receiving ACT alone. Conversely, preconditioning with GemHCl at the same dose did not result in a similar survival benefit. PolyArg NCs were loaded with a fluorinated shRNA specific for mouse C/EBPβ transcription factor, which is known to be required for tumor-induced MDSC expansion and acquisition of immunosuppressive functions.PolyArgNCs loaded with the C/EBPβ-specific shRNA (NC-shC/EBPβ) efficiently down-regulated target gene expression in an immortalized MDSC cell line.In vivo, we reported a significant reduction of C/EBPβ mRNA levels in splenic and tumor-infiltrating myeloid cells, following repeated administration of NC-shC/EBPβ to mice bearing MCA203 subcutaneous sarcomas. The present datasupport the use of LNC-GemC12 as MDSC-targeted agent in cancer immunotherapy, notably in combination with ACT. As compared with standard MDSC-depleting chemotherapeutic drug formulations, LNC-GemC12 bears the potential of achieving significant effects at very low, likely not toxic, drug doses. Moreover, the use of a drug already employed in clinical oncology, combined with a biocompatible delivery nanosystem, might facilitate clinical translation.We also provided an initial evidence that shRNA-loaded PolyArg NCs allow to downregulate target gene expression in myeloid cellsin vivo, and could be exploited to therapeutically modulate tumor-associated myeloid cells.  

Nell’ultimo decennio l’impiego di diversi tipi di immunoterapia dei tumori ha consentito di ottenere risposte cliniche e un miglioramento della sopravvivenza in pazienti non rispondenti alle terapie convenzionali. Tuttavia, l’efficacia dell’immunoterapia del cancro è limitata dalla presenza di popolazioni di cellule immunitarie con proprietà immunosoppressive e pro-tumorali che si espandono durante la patogenesi della malattia. Tali cellule comprendono popolazioni di origine mieloide, quali i macrofagi associati al tumore (tumor associated macrophages, TAMs), e cellule soppressive di derivazione mieloide (myeloid derived suppressor cells, MDSCs). Pertanto, per lo sviluppo di protocolli d’immunoterapia ottimali sono necessari trattamenti di supporto, con buona efficacia e bassa tossicità, in grado di contrastare l’immunosoppressione indotta dal tumore. Diversi studi preclinici e clinici hanno dimostrato che i nanosistemi per il trasporto di farmaci antitumorali sono in grado di migliorarne le proprietà farmacologiche aumentandone l’emivita, favorendone l’accumulo nel sito tumorale e limitando la tossicità a carico di tessuti sani. Inoltre, i nanosistemi per il trasporto di RNA sono attualmente impiegati nello sviluppo di terapie antineoplastiche che utilizzano approcci di silenziamento genico in vivo basati sul meccanismo dell’Interferenza a RNA (RNAi). L’uso di nanosistemi per il trasporto di farmaci ed RNA che hanno come target le cellule sistema immunitario, oltre alle cellule tumorali, sembra essere un nuovo e promettente approccio per potenziare l’efficienza dell’immunoterapia dei tumori. In questo lavoro abbiamo valutato l’efficaciadi due diverse formulazioni di nanotrasportatori, caricati con farmaci o RNA, come agenti immunomodulanti per alterare la presenza e/o funzione delle cellule mieloidi associate al tumore. La prima formulazione consiste in una forma modificata di gemcitabina incapsulata in nanocapsule lipidiche (LNC-GemC12); la seconda è costituita da nanocapsule rivestite di poliarginina (PolyArgNCs) caricate con short hairpin (sh) RNA, per il silenziamento genico in vivo mediante RNAi. Nel modello tumorale murino EG7-OVA, la somministrazione di LNC-GemC12 e di gemcitabina idrocloruro (GemHCl, l’attuale formulazione standard per la gemcitabina), ad un dosaggio molto basso, causa una deplezione selettiva delle MDSC monocitarie (M-MDSCs) nella milza e nel sito tumorale. In particolare, alla somministrazione di LNC-GemC12, rispetto alla GemHCl, si associa una riduzione più intensa e prolungata delle M-MDSCs tumorali ed una conseguente attenuazione dell’attività soppressiva delle MDSC infiltranti il tumore nei confronti dei linfociti T. Inoltre, nello stesso modello, il trattamento con LNC-GemC12 prima della somministrazione di una terapia di trasferimento cellulare adottivo (ACT) con linfociti T OVA-specifici, risulta in un miglioramento della sopravvivenza rispetto al solo trattamento mediante ACT. In confronto, il pre-trattamento con GemHCl alla stessa dose non si associa ad un’estensione della sopravvivenza dopo ACT. Nella seconda parte di questo lavoro, le PolyArg NC sono state caricate con un shRNA fluorinato specifico per il fattore di trascrizione murino C/EBPβ, la cui espressione è necessaria per l’espansione e l’induzione di funzioni immunosoppressive nelle MDSC. Le PolyArg NC caricate con l’shRNA C/EBPβ-specifico (NC-shC/EBPβ) sono state impiegate con successo per ridurre l’espressione del gene bersaglio in una linea cellulare di MDSC immortalizzate. Successivamente, abbiamo valutato il funzionamento di questo sistema in vivo in un modello murino di sarcoma sottocutaneo. In questo modello abbiamo riportato una riduzione significativa nei livelli di mRNA di C/EBPβ nelle cellule mieloidi spleniche e intratumorali a seguito della somministrazione ripetuta di NC-shC/EBPβ. I dati ottenuti in questo lavoro supportano la validità dell’uso delle LNC-GemC12 come agente per la modulazione delle MDSC nell’immunoterapia del cancro, in particolare in combinazione con l’ACT. Rispetto alle formulazioni standard di agenti chemioterapici in grado di ridurre la frequenza delle MDSC, le LNC-GemC12 hanno il potenziale di fornire un’efficacia terapeutica a dosaggi di farmaco molto bassi e verosimilmente non tossici. In aggiunta, l’utilizzo di un farmaco già in uso nella pratica clinica, combinato con una formulazione di nano capsule lipidiche biocompatibili, potrebbe facilitare la traslazione in ambito clinico di questo approccio. Nel presente studio, abbiamo inoltre fornito una prima validazione dell’efficacia in vivo delle PolyArg NC caricate con shRNA come strumento per ridurre l’espressione di geni bersaglio nelle cellule mieloidi associate al tumore, potenzialmente impiegabile come agente immunomodulante nella terapia del cancro.