Colonization ability of autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains in mixed culture fermentation and in vineyard environment

Yeast is the main protagonist of the alcoholic fermentation and, together with the grape juice quality, determines the final wine characteristics. Responding to the consumer requests of more "natural" wine products without additives that keep sensory characteristics of the production area, the most challenging enology is focused to perform spontaneous fermentation in which the interactions among autochthonous microorganisms present in must determine better sensory characteristics, traditionally related to the production area. In this context the first part of this thesis project was developed. This involved the inoculum of autochthonous Saccharomyces cerevisiae strains, isolated in the winemaking area of Prosecco Superiore di Conegliano Valdobbiadene DOCG, in two vineyards belonging to this production area, one cultivated using conventional practices and the other grown under organic farming methods. Their ability to colonize the vineyard was assessed and spontaneous fermentations with grapes coming from the inoculated vine rows were performed. The results of barks sampling performed for two consecutive years showed that the presence of inoculated strains in the vineyard was very poor and limited to the first six months after treatment, regardless of the cells concentration of the inoculated suspension. Similar results were obtained when the strains present in the fermenting grape musts, during spontaneous vinifications performed in the two vintages, were genetically characterized. A very small percentage was identified as to be some of the inoculated strains. Surprisingly, the fermenting grape musts were colonized mainly by commercial strains, used from the local wineries, present on grape bunches at harvest. With the aim to understand the interaction mechanisms that occur among different S. cerevisiae strains during alcoholic fermentation, eight autochthonous strains (among them the five yeast released in vineyard were present) were pairwise inoculated in synthetic must. The kinetics produced by the co-fermentations not always reproduced those of the dominant strains when evaluated in single-strain fermentations, but on the contrary, the presence of a second strain deeply influences the fermentation kinetics, improving or sometime worsening the fermentation trend. The best competitor was a strain with neutral killer phenotype. These results highlight the existence of other factors than the killer character involved in must colonization. In the last part of this thesis work the hypothesis if the must colonization ability could depends on yeast nutrient request that influence the nutrient availability to the rest of microbiota, was tested. Therefore the nitrogen request of the wine industrial strain QA23 was investigated in comparison with those of three autochthonous S. cerevisiae strains chosen among the yeasts previously tested in co-fermentations in synthetic must. In order to investigate if different nitrogen needs could influence colonization ability during must fermentation, pairwise strain fermentations were performed in synthetic must with high and low nitrogen level. Results suggested a strong implication of nitrogen assimilation ability on must colonization. The strain with highest nitrogen demand is the one that strongest opposed to QA23 colonization. During the fermentation its colonization ability increased, indicating better performance when nitrogen was depleted. The knowledge of the specific phenotypic characteristics of the strains, besides the genetic characterization, proved to be crucial to understand and control the composition of the microbial flora presents in the must and in the vineyard environment. The management of the colonization dynamics is proposed as powerful tool in the hands of winemakers and valid alternative to the use of additives in winemaking. The yeast Saccharomyces cerevisiae after about 7000 years remains the main protagonist of winemaking and the maintenance of its biodiversity proved to be the key to guarantee the production of wines with new sensory characteristics.

Il lievito è il protagonista principale della fermentazione alcolica ed assieme alla qualità del mosto di partenza determina le caratteristiche finali del vino. In risposta alla richiesta da parte dei consumatori di vini “naturali”, prodotti senza aggiunta di additivi, e con profili sensoriali caratteristici della zona di produzione, la sfida enologica è orientata all’ottenimento di fermentazioni spontanee in cui le interazioni che avvengono tra i microrganismi autoctoni presenti nei mosti determinano caratteristiche sensoriali migliori e tradizionalmente legate al territorio di produzione. In questo contesto si inserisce la prima parte del progetto di questa tesi che ha previsto l’inoculo di ceppi autoctoni (ecotipici) di Saccharomyces cerevisiae isolati nell’area del Prosecco Superiore di Conegliano Valdobbiadene DOCG, in due vigneti appartenenti a questa zona di produzione, uno coltivato con tecniche agronomiche biologiche e l’altro gestito in modo convenzionale. È stata valutata la loro capacità di colonizzare l’ambiente vigneto e di avviare una fermentazione spontanea nei mosti ottenuti con l’uva proveniente dai filari inoculati. I risultati dei campionamenti di porzioni di ritidoma eseguiti per due anni consecutivi dimostrano che la presenza dei ceppi inoculati in vigneto è molto bassa e limitata ai primi sei mesi dal trattamento, indipendentemente dalla concentrazione cellulare della sospensione inoculata. Anche durante il processo di fermentazione del mosto, durante le microvinificazioni condotte con l’uva raccolta dai due vigneti nei due anni di sperimentazione, si osservano percentuali di presenza molto basse di alcuni ceppi inoculati. Nelle fermentazioni si sono imposti lieviti commerciali usati dalle cantine dell’areale di produzione considerato in questo studio, e che sono presenti sui grappoli d’uva in epoca di raccolta. Con lo scopo di comprendere i meccanismi d’interazione tra ceppi appartenenti alla specie Saccharomyces cerevisiae durante la fermentazione alcolica, otto ceppi autoctoni (tra cui quelli usati nell’esperienza di rilascio in vigneto) sono stati inoculati a coppie in mosto sintetico. Dall’analisi delle performances fermentative e della loro abilità di colonizzare il mosto si osserva che non sempre la cinetica di fermentazione prodotta dal co-inoculo riproduce quella del ceppo dominante, ma al contrario, la presenza di un secondo ceppo influenza la cinetica di fermentazione, migliorandola o peggiorandola. Il ceppo di lievito che maggiormente è riuscito ad imporsi nelle prove di fermentazione non presenta fenotipo killer dimostrando che altri fattori, oltre al carattere killer, condizionano la colonizzazione del mosto. Per testare l’ipotesi che la capacità di “dominare” le fermentazioni derivi dalla capacità di sottrarre nutrienti agli altri ceppi, l’ultima parte di questo lavoro di tesi ha riguardato lo studio delle richieste di azoto di un ceppo commerciale QA23 e di tre ceppi di vigneto (scelti tra quelli già studiati nelle precedenti prove di co-fermentazione). Inoltre è stato studiato il ruolo della disponibilità di azoto nelle dinamiche di colonizzazione alle stendo prove di co-inoculo in mosto sintetico con alta e bassa concentrazione di azoto. Dai risultati si osserva che il ceppo che presenta maggiori richieste di azoto si oppone maggiormente alla colonizzazione del ceppo commerciale, e la sua capacità di colonizzare il mosto aumenta in condizioni di basse concentrazioni di azoto. La conoscenza delle caratteristiche fenotipiche specifiche dei ceppi, oltre che la caratterizzazione genetica, si dimostrano fondamentali per comprendere e controllare la composizione della flora microbica presente nei mosti e nell’ambiente vigneto. La gestione delle dinamiche di colonizzazione si propongono come valido strumento a disposizione dell'enologo e valida alternativa all’uso di additivi in vinificazione. Il lievito Saccharomyces cerevisiae dopo circa 7000 anni si conferma il principale protagonista dell'arte enologica e il mantenimento della sua biodiversità si rivela la chiave per garantire la produzione di vini con sempre nuove caratteristiche sensoriali.