Chemical elaboration of synthetic and natural bioactive compounds to improve bioavailability and activity

The project aimed to synthesize new prodrugs of bioactive molecules and new self-assembling fully biocompatible macromolecular structures as vehicles for drug delivery. Initially, I worked on the chemical modification of the phenolic group of pterostilbene – a natural bioactive polyphenol used as model in this study – in order to improve its bioavailability after oral administration. I synthesized and tested new pterostilbene derivatives using five different types of protecting groups to functionalize the hydroxyl group and convert the natural phenol, specifically, into a methylthiomethyl ether (MTM), a phosphonic ester, an alkylcarbonyloxymethyl (ACOM) ether, an alkyloxycarbonyloxymethyl (AOCOM) ether and an N-alkyl-N-alkyloxycarbonylaminomethyl (NANAOCAM) ether. The derivatives display very different chemical stability profiles. In preliminary screenings, the AOCOM and ACOM derivatives gave the best results in terms of chemical and biological stability. These compounds were thus tested in pharmacokinetic experiments in vivo. The blood concentration vs. time profiles of pterostilbene and its sulfate obtained with the ACOM prodrug were very similar to those determined after administrating pterostilbene as such. Those afforded by the AOCOM derivative showed instead a considerable shift to longer times after administration, indicating that it indeed behaves as a prodrug. During the second year, I developed two new classes of selective tumor killing agents based on the natural phenol 5-hydroxypsoralen and on the anti-leprosy drug clofazimine. The aim of this part of my project was the design, synthesis and test of novel selective inhibitors of the mitochondrial potassium channel Kv 1.3. This channel is expressed in the inner mitochondrial membrane of many types of cancer cells and its inhibition plays an important role in the induction of apoptosis. In a series of in vitro and in vivo tests three of my psoralen derivatives (patented) proved to be remarkably effective. As for the clofazimine derivatives, only a few in vitro assays have been performed so far and further in depth tests are currently under way. More recently, during the time I spent at ETH in Zürich, I worked on the design and synthesis of biocompatible polymeric micelles for drug delivery. In particular, I developed and characterized a series of novel resveratrol –OEG-co-adipate and polymethyloxazolines -co-pterostilbene based copolymers that self-assemble in water to form core-shell nanocarriers. In order to test their ability as nanocarriers I loaded them with clofazimine and studied their behavior under various experimental conditions. In the case of polyoxazolines-co-pterostilbene constructs, these preliminary tests gave encouraging results which prove the value of this approach to obtain a highly modular copolymer platform to be used for the safe delivery of its drug load into solid tumors by exploiting the Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect.

Lo scopo del progetto è la sintesi di nuove molecole di interesse biomedico e di nuovi co-polimeri auto-assemblanti completamente biocompatibili per il drug delivery di farmaci. Inizialmente, mi sono dedicato allo studio ed all'applicazione di diversi gruppi protettori delle funzionalità fenoliche di composti naturali bioattivi, utilizzando come modello lo pterostilbene. Ho effettuato uno screening di possibili gruppi protettori bioreversibili seguendo un approccio prodrug al fine di migliorare la biodisponibilità dello pterostilbene a seguito della somministrazione orale. Ho sintetizzato cinque diverse tipologie di prodrugs in cui il composto fenolico è funzionalizzato ad estere fosfonico, metil tiometil etere (MTM), alchilcarbonilossimetil (ACOM) etere, alchilossicarbonilossimetil (AOCOM) etere ed N-alchil-N-alchilossicarbonilaminometil (NANAOCAM) etere. Questi derivati mostrano profili idrolitici, sia in mezzi acquosi a vari pH che in sangue di ratto, molto diversi e modulabili in funzione del gruppo utilizzato come promoiety. In questi saggi i derivati protetti con il gruppo AOCOM ed ACOM hanno dato i risultati migliori e sono stati quindi utilizzati in studi farmacocinetici in vivo. I grafici della concentrazione in sangue dello pterostilbene e del suo solfato – il principale metabolita - contro il tempo nel caso del derivato ACOM sono risultati molto simili a quelli ottenuti mediante somministrazione dello pterostilbene stesso. Nel caso del precursore AOCOM si osserva invece un netto spostamento a tempi più lunghi, il che indica che il composto si comporta in effetti come prodrug. Durante il secondo anno di dottorato, ho sintetizzato due nuove classi di antitumorali selettivi derivati rispettivamente del 5-idrossipsoralene (composto naturale) e della clofazimina (farmaco anti-lebbra). Questi nuovi agenti chemioterapici (brevettati) agiscono inibendo il canale del potassio Kv 1.3 che risulta essere largamente espresso nella membrana interna mitocondriale di molti tipi di cellule tumorali. L'inibizione di tale canale porta alla morte cellulare per apoptosi. Dopo una serie di test in vitro, ex vivo ed in vivo, sono stati selezionati tre composti psoralenici che risultano particolarmente promettenti. I test dei derivati della clofazimina sono tuttora in corso. Nel corso dell'ultimo anno di dottorato e soprattutto durante il periodo di collaborazione all'estero presso il Politecnico Federale di Zurigo (ETH) mi sono occupato della sintesi di nuove strutture macromolecolari auto-assemblanti per il drug delivery di farmaci antitumorali. In particolare, ho sviluppato e testato una serie di co-polimeri polimetilossazolina-co-pterostilbene e resveratrolo-OEG-co-adipato in grado di auto-assemblare in acqua dando nanostrutture polimeriche stabili e capaci di rilasciare nel tempo i principi attivi con cui vengono prodotte e caricate. La scelta di incorporare in questi nanocarrier clofazimina è dovuta alla sua nota attività di inibizione delle pompe per la resistenza multifarmaco (MDR pumps) ed al suo nuovo potenziale impiego come agente antitumorale. I risultati conseguiti con i copolimeri di polimetilossazolina e pterostilbene mostrano la validità dell’approccio adottato in questo progetto per creare strutture co-polimeriche altamente modulabili in grado di veicolare farmaci antitumorali in tumori solidi sfruttando l'effetto EPR (Enhanced Permeability and Retention).