Nutritional strategies to reduce methane emissions in dairy cows using in vitro technique

Due to the warming of the climate system, public opinion has increased its interest in greenhouse gas, with particular predilection for methane (CH4 ) and their relationship with livestock sector. For this reason, several researches have proposed different nutritional strategies to reduce methane production in ruminants. The two main aims of this thesis were: i) to study methodological factors affecting in vitro CH4 production and to develop a new approach to measure in vitro CH4 production; ii) to evaluate effectiveness of some nutritional strategies on in vitro CH4 reduction. The objectives have been achieved through the research activities and reported in five experimental contributions. The first contribution aimed to analyse specific factors affecting in vitro gas production (GP), CH4 production and their ratio by a meta-analysis approach using 274 control treatments from 39 scientific papers published over 12 years. The common factors included in the analysis were: the pressure in the GP equipment (constant or increasing), the incubation time (24 or ≥48 h), the timing of rumen fluid collection (before or after feeding of donor animals), the presence of N in the buffer solution (presence or absence), and the ratio between amount of buffered rumen fluid and feed sample (<130 or 130-140 or >140 ml/g DM). The NDF content of feed sample incubated (392 ± 175.3 g/kg) was considered as a continuous variable. Results showed that GP measures were influenced mainly by the incubation time; values of CH4 production were affected mainly by the ratio between amount of buffered rumen fluid and feed sample; values of CH4 proportion (CH4 /GP) were mainly affected by timing of rumen fluid collection. Results suggest that factors considered in the meta-analysis explained a significant part (about 65%) of variability of GP and CH4 measures obtained in vitro. Thus, a higher standardization of specific methodological protocols would be desirable in order to compare results of different trials. The second contribution compared two in vitro techniques (closed or vented bottles) of sampling and measuring CH4 production from ruminant feeds. Five feeds (meadow hay, ryegrass hay, corn grain, dry sugar beet pulp, and expeller flaxseed) were tested. The experimental design was: 2 incubations×5 feeds×3 replications×2 gas sampling techniques, plus 4 blanks (bottles without feed sample), for a total of 64 bottles incubated. Half of the bottles were not vented during the incubation, whereas the remaining were vented at a fixed pressure and gas was collected into a tight bag connected to each bottle. At the end of each incubation, gas samples were sampled from the headspace of closed bottles or from headspace and bags of vented bottles and analyzed for CH4 concentration. GP values were adjusted or not for the amount of CO2 solubilized in the fermentation fluid. Values of CH4 concentration (ml CH4 /100 ml gas) and production (ml CH4 /g DM) were computed using corrected or uncorrected GP values. Closed bottles showed lower uncorrected GP (−18%) compared with vented bottles, whereas the correction for dissolved gas reduced but did not remove differences between techniques. Closed bottles showed unadjusted CH4 concentrations 23% greater than that of vented bottles, but the adjustment of measurements for solubilized CO2 reduced but did not remove this difference. Adjusted CH4 production was not influenced by technique. Closed bottles provide good measurements of CH4 production but not of GP. Venting of bottles at low pressure permits a reliable evaluation of total GP and CH4 production. The third contribution evaluated the influence that changes in main dietary constituents (starch:ADF ratio, protein and lipid contents) could have on in vitro GP, CH4 concentration and production. All changes have been made within ranges of diets used in intensive farms of the North Italy. A reference diet was used (273, 361, 158, and 33 g/kg DM of starch, aNDF, CP, and lipids, respectively). Other 6 diets had a smaller or a greater starch:ADF ratio (0.40 or 1.77, respectively), CP content (115 or 194 g/kg DM, respectively), or lipid content (26 or 61 g/kg DM, respectively), compared to the reference diet. The experimental design was: 4 incubations × 7 diets × 5 replications, plus 20 blanks (5 blanks/run), for a total of 160 bottles. Bottles were vented at fixed pressure and at the end of each incubation, gas samples were collected from the bottle headspace and analyzed for CH4 . The proportion of CH4 lost with venting was estimated. An increasing starch:ADF ratio reduced GP per g DM and per g TDMd, increased the amount of CH4 produced per g DM, whereas CH4 produced per g TDMd was unchanged. The increase of CP content decreased GP, whereas CH4 production was reduced in low protein diet only when expressed as proportion of GP. The increase of lipid content reduced GP per g DM, but no influences were observed on CH4 values. Results of this study showed that the magnitude of effects exerted by the dietary changes on in vitro fermentation was small. The fourth contribution aimed to explore effects of 4 pure plant extracts (allyl-sulfyde; cinnamaldehyde; eugenol; limonene) and 1 synthetic compound (monensin), all with antimicrobial properties, added to a commercial diet for dairy cows, on GP, CH4 concentration and production. Two dosages were tested: 3 or 30 mg/g of diet for pure plant extracts, 0.015 or 0.030 mg/g of diet for monensin. Incubation procedures were the same as the previous experiment. The experimental design was: 4 incubations×5 additives×2 dosages×3 replications, plus 12 bottles as control (without additive; 3/run) and 12 bottles as blanks (3/run), for a total of 144 bottles. Results showed that low dosages of all compounds did not exert any effect on in vitro GP and CH4 production. Compared to the control, high dosage of allyl-sulfyde, cinnamaldehyde, eugenol, limonene, and monensin significantly reduced in vitro GP (ml/g DM; -16%, -12%, -9%, -38%, -12%, respectively). In vitro CH 4 production was significantly reduced only by high dosage of allyl-sulfyde, cinnamaldehyde, limonene, and monensin (-32%, -12%, -43%, -18%, respectively, compared to the control). Only high dosage of allyl-sulfyde and limonene significantly reduce CH4 proportion (-18%, -12% respectively, compared to the control). The most promising results were observed for cinnamaldehyde, as the depression of CH4 production was not accompanied by a reduction of in vitro degradability. The fifth contribution investigated the possibility to reduce in vitro gas and CH4 production by combining a direct inhibitor of methanogenisis (chloroform) with two indirect inhibitors: i) nitrate, acting as a H2 sink, and ii) saponins, acting as antiprotozoal agent. The experiment was conducted using a semi-continuous flow system (RUSITEC ®). A diet, based on grass hay, was incubated alone (diet 1) or supplemented with 31.5 g/kg of nitrate (diet 2) or with 50 g/kg of saponins extracted from ivy extract (diet 3). Three diets were incubated without or with chloroform (2 µL/L), obtaining a total of 6 dietary treatments. Each of the 6 dietary treatments was incubated in four vessels, for a total of 24 vessels. Each vessel was inoculated with 800 ml of buffered rumen fluid. Whole incubation lasted 21 d. Total GP (on average 2.56 L/d) was not affected by diet or chloroform addition. When incubated alone, chloroform, nitrate and saponins reduced daily CH4 production by 96, 66 and 22%, respectively. However, when chloroform was combined with indirect inhibitors, neither nitrate or saponins had any additional effect in chloroform treated vessels on in vitro CH4 production. Results suggest that no synergistic effects emerged between the direct inhibitor and the two indirect inhibitors.

Il recente scenario del riscaldamento climatico globale, ha portato ad un maggiore interesse dell’opinione pubblica riguardo ai gas che causano l’effetto serra, ponendo particolare attenzione al gas metano (CH4 ) e alla sua relazione con il settore zootecnico. Per questa ragione, numerosi gruppi di ricerca hanno proposto delle strategie nutrizionali per ridurre le emissioni di CH4 da parte dei ruminanti. Nella presente tesi sono stati sviluppati due obiettivi principali. Il primo riguardava lo studio dei fattori metodologici che influenzano la produzione in vitro del CH4 e lo sviluppo di un nuovo approccio per la misurazione dello stesso gas prodotto durante delle fermentazioni in vitro. In secondo luogo, si è inteso valutare l’efficacia di alcune strategie nutrizionali sulla riduzione della produzione di CH4 . Tali obiettivi sono stati raggiunti attraverso cinque diverse attività di ricerca. Nel primo lavoro è stato valutato l’effetto che specifici fattori metodologici possono avere sulla produzione in vitro di gas e di CH4 (espresso sia in termini di produzione che di proporzione). Questa analisi è stata effettuata attraverso un approccio di meta-analisi utilizzando 274 osservazioni, che rappresentavano i trattamenti di controllo di 39 articoli scientifici pubblicati negli ultimi 12 anni. I fattori considerati erano: la pressione che si forma nello spazio di testa dello strumento utilizzato per le fermentazioni in vitro (costante o incrementale), il tempo di incubazione (24 o ≥48 ore), il momento di raccolta del liquido ruminale (prima o dopo la somministrazione del pasto agli animali donatori), la presenza di azoto nella composizione della saliva artificiale (presenza o assenza), e il rapporto tra la miscela di liquido ruminale e saliva artificiale sul campione alimentare incubato (130 or 130-140 or >140 ml/g DM). Questi cinque fattori sono stati considerati come variabili discrete, invece il contenuto di NDF del campione alimentare incubato (392 ± 175.3 g/kg) è stato considerato come variabile continua. I risultati hanno mostrato che la produzione totale di gas è principalmente influenzata dal tempo di incubazione, mentre la produzione di CH4 è influenzata soprattutto dal rapporto tra la miscela di liquido ruminale e saliva artificiale sul campione alimentare incubato. Quando invece il CH4 viene espresso in termini di proporzione sul gas totale prodotto, i valori sono principalmente influenzati dal momento di raccolta del liquido ruminale. Inoltre, questa meta-analisi dimostra che i fattori considerati spiegavano una parte considerevole (circa il 65 %) della variabilità dei dati di gas e CH4 prodotti durante le fermentazioni in vitro. Quindi, sarebbe desiderabile una maggiore standardizzazione dei protocolli metodologici internazionali, in modo da facilitare il confronto di dati ottenuti in diversi sperimentazioni. Il secondo contributo sperimentale ha inteso mettere a punto una procedura di raccolta e di misurazione del CH4 prodotto, utilizzando due diverse tipologie di fermentazione in vitro: i) un “sistema aperto”, con sfiato regolare del gas all’interno di un sacchetto connesso alle bottiglie di fermentazione, dal quale viene prelevato il campione di gas per l’analisi del CH4 ; ii) un “sistema chiuso”, con accumulo progressivo dei gas di fermentazione nello spazio di testa delle bottiglie, dal quale viene prelevato il campione per l’analisi del CH4 . Per le fermentazioni sono stati usati cinque alimenti singoli utilizzati nell’alimentazione dei ruminanti (fieno polifita, loietto, farina di mais, panello di lino e polpe di bietola). Il disegno sperimentale prevedeva: 2 incubazioni × 5 alimenti × 3 replicazioni per alimento × 2 tecniche di campionamento del gas, più 4 bianchi (bottiglie incubate senza campione alimentare), per un totale di 64 bottiglie incubate. Metà delle bottiglie non venivano sfiatate, mentre le rimanenti venivano sfiatate a pressione fissa e il gas era raccolto in un sacchetto a tenuta connesso ad ogni bottiglia. Alla fine di ogni incubazione, il gas veniva campionato dallo spazio di testa delle bottiglie utilizzate per il sistema chiuso o dallo spazio di testa e dal sacchetto delle bottiglie utilizzate per il sistema aperto. Tutti i campioni sono stati poi analizzati per quantificare la concentrazione di CH4 . I valori di gas prodotto venivano o meno corretti per la quantità di CO2 che si era disciolta nel liquido di fermentazione. I valori di produzione (ml CH4 /g DM) e di proporzione (ml CH4 /100 ml gas) di CH4 sono stati calcolati utilizzando i valori corretti o non corretti di produzione di gas totale. Il sistema chiuso ha mostrato una produzione di gas totale non corretto inferiore (-18%) rispetto al sistema aperto, mentre la correzione del gas ha ridotto ma non rimosso le differenze tra le due tecniche. Le bottiglie chiuse hanno mostrato una proporzione di CH4 non corretto superiore (+23%) rispetto al sistema aperto, mentre la correzione ha ridotto ma non rimosso le differenze tra le due tecniche. La produzione di CH4 corretto non è stata influenzata dalla tecnica utilizzata. Concludendo, il sistema chiuso non offre buone misurazioni della produzione del gas, mentre il sistema aperto consente una valutazione attendibile sia del gas che del CH4 prodotto. Nel terzo contributo sperimentale è stato valutato l’effetto che le variazioni quantitative dei principali componenti chimici (rapporto amido:ADF, contenuto proteico e contenuto lipidico) di diete per vacche da latte, posso avere sulla produzione di gas e CH4 . Le variazioni sono state fatte tenendo conto degli intervalli di fibra, amido, proteina e lipidi effettivamente utilizzate negli allevamenti intensivi del Nord Italia. La dieta di riferimento utilizzata aveva la seguente composizione chimica: 273, 361, 158, e 33 g/kg SS di amido, NDF, CP, e lipidi, rispettivamente. Le altre 6 diete avevano un minore o maggiore rapporto di amido:ADF (0.40 or 1.77, rispettivamente), o di contenuto proteico (115 or 194 g/kg DM, rispettivamente), o di contenuto lipidico (26 or 61 g/kg DM, rispettivamente), rispetto alla dieta di riferimento. Il disegno sperimentale prevedeva: 4 incubazioni × 7 diete × 5 replicazioni per dieta, più 20 bianchi (bottiglie incubate senza campione alimentare), per un totale di 160 bottiglie incubate. Il gas prodotto veniva regolarmente sfiatato a pressione fissa e alla fine di ogni incubazione un campione di gas veniva raccolto dallo spazio di testa delle bottiglie e veniva analizzato per misurare la concentrazione di CH4 . La quantità di CH4 perso durante lo sfiato del gas di fermentazione è stata stimata. I risultati mostrano che all’aumentare del rapporto amido:ADF si riduce la produzione di gas (per g di SS e per g di degradabilità "vera" della SS), aumenta la produzione di CH4 (per g di SS), mentre la produzione di CH4 espressa come g di degradabilità "vera" della SS non varia. All’aumentare del contenuto proteico si riduce la produzione di gas, mentre la proporzione di CH4 è stata ridotta solo nella dieta ipoproteica. L’aumento del contenuto lipidico ha ridotto la produzione di gas (per g di SS), ma non ha influenzato i valori di CH4 . Si può quindi concludere che l'entità degli effetti, esercitati dalle variazioni quantitative dei principali componenti chimici delle diete sulla fermentazione in vitro, è stata quasi inesistente. Il quarto lavoro ha inteso valutare l’effetto di quattro estratti puri di piante (allil-sulfide, cinnamaldeide, eugenolo e limonene) e di un composto sintetico (monensin), tutti con proprietà antimicrobiche, utilizzati come additivi di una dieta per vacche da latte, sulla produzione di gas e CH4 . Sono stati utilizzati due diversi dosaggi: 3 or 30 mg/g di per gli estratti puri di piante, 0.015 or 0.030 mg/g di dieta per il monensin. Le procedure di incubazioni utilizzate erano le stesse dell’esperimento precedente. Il disegno sperimentale prevedeva: 4 incubazioni × 5 additivi × 2 dosaggi × 3 replicazioni, più 12 bianchi (bottiglie incubate senza campione alimentare, 3 per incubazione), e 12 controlli (dieta incubata senza additivi, 3 per incubazione) per un totale di 144 bottiglie incubate. I risultati hanno mostrato che tutti i composti testati con il basso dosaggio non hanno mai influenzato la produzione in vitro di gas e CH4 . Rispetto al controllo, gli alti dosaggi di allil- sulfide, cinnamaldeide, eugenolo, limonene, e monensin hanno ridotto significativamente la produzione in vitro di gas (ml/g DM; -16%, -12%, -9%, -38%, -12%, rispettivamente). La produzione in vitro di CH4 è stata significativamente ridotta solo dell’alto dosaggio di allil-sulfide, cinnamaldeide, limonene, e monensin (-32%, -12%, -43%, -18%, rispetto al controllo). Solo gli alti dosaggi di allil- sulfide e limonene hanno ridotto significativamente anche la proporzione di CH4 (-18% e -12% rispetto al controllo). I risultati più promettenti sono stati osservati per la cinnamaldeide, che ha depresso la produzione CH4 senza influenzare negativamente gli altri parametri fermentativi. Il quinto e ultimo contributo sperimentale ha valutato la possibilità di ridurre la produzione in vitro di gas e CH4 attraverso la combinazione di un diretto inibitore del CH4 (cloroformio) con due inibitori indiretti: i) i nitrati, che agiscono come accettori di idrogeno e ii) le saponine, dei noti agenti antiprotozoari. L’esperimento è stato condotto utilizzando un sistema di simulazione ruminale a flusso semi-continuo (RUSITEC®). Una dieta base è stata incubata singolarmente (dieta 1) o addizionata con 31.5 g/ kg di nitrati (dieta 2) o con 50 g/kg saponine ottenute dall’estratto d’edera (dieta 3). Queste tre diete sono state incubate senza o con l’aggiunta di cloroformio (2 µL/L), ottenendo un totale di 6 trattamenti testati. Ogni trattamento è stato incubato in quattro bottiglioni, per un totale di 24 bottiglioni. L’intera incubazione è durata 21 giorni. I risultati mostrano che la produzione totale di gas (in media 2.56 l/d) non è stata influenzata dalla dieta o dalla presenza del cloroformio. Quando utilizzati singolarmente, cloroformio, nitrati e saponine riducono la produzione giornaliera di CH4 del 96, 66 e 22%, rispettivamente. Nonostante ciò, quando il cloroformio era combinato con inibitori indiretti, non si è evidenziato nessun effetto addizionale sulla riduzione di CH4 prodotto. Concludendo, si può quindi affermare che nessun effetto sinergico è emerso tra l’inibitore diretto di CH4 e i due inibitori indiretti.