Protein kinase CK2 in diffuse large b-cell lymphoma: defining its role to shape new therapies

CK2 is a highly conserved Ser/Thr protein kinase, consisting of two catalytic (a) and two regulatory (b) subunits assembled to form a tetramer. It is involved in a broad variety of cellular processes, among which survival, proliferation, differentiation, DNA damage and other stress responses, leading to the activation of context-specific transcription factors such as c-Myc and NF-kB. This kinase has been found overexpressed in several solid tumors and hematologic malignancies, and its overexpression seems to be an unfavorable prognostic marker. It has been fully demonstrated that CK2 acts as a potent antiapoptotic factor that promotes a “non-oncogene addiction” phenotype in cancer cells. In other words, high CK2 levels and activity contribute to create a cellular environment favorable to the establishment and maintenance of a neoplastic phenotype. In particular, it was recently shown that many B-cell derived tumors, like multiple myeloma, mantle cell lymphoma and chronic lymphocytic leukemia, rely on high CK2 activity and that its downmodulation induces malignant cell death without significantly affecting normal B lymphocytes. Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) is an aggressive B-cell derived neoplasia that originates from follicles and is the most common type of non-Hodgkin lymphoma, accounting for about 40% of all cases. It is divided into two subtypes: Germinal Center B-cell like (GCB) and Activated B-Cell like (ABC) DLBCL, characterized by different genetic lesions and, therefore, variable response to therapy. Up to one-third of patients does not achieve cure with initial therapy and has refractory disease or relapse. The standard salvage treatment for these patients is autologous stem cell transplantation, but success rates are poor and most of them succumb to the disease. These facts clearly demonstrate the need for new rational combination therapeutics. It is well known that the B-Cell Receptor (BCR) signalling strongly influences B-cell development and is fundamental for peripheral B-cell survival. After BCR ligation by the antigen, the signal is transduced across the plasma membrane and propagated inside the cell through a group of intracellular proteins, which interact to form a complex, called signalosome. Among these proteins there are the tyrosine kinases SYK and BTK, the phospholipase PLCg2 and the adaptor BLNK. Once activated by SYK, BTK phosphorylates PLCg2, which in turn generates IP3 thus causing Ca++ release from the endoplasmic reticulum stores. Ca++ acts in the cytoplasm as a second messenger that binds several Ca++-dependent proteins that are then able to activate transcription factors, like NFAT and NF-kB, modifying gene expression. The result of this process consists in activation, expansion, antigen presentation and B-cell differentiation. For these reasons, it comes as no surprise that inhibitors targeting the BCR signalling have shown promising therapeutic outcomes for patients with B-cell lymphomas. Here we show that a and b subunits of protein kinase CK2 are overexpressed in ABC- and GCB-DLBCL primary patient samples and immortalized cell lines when compared with normal counterparts. Moreover, we demonstrate that CK2 inhibition with CX-4945, an ATP-competitive CK2 inhibitor currently under clinical trials, causes apoptosis of DLBCL cell lines in a dose and time dependent fashion, and that malignant cell death is significative even at low drug doses not toxic to normal counterparts. We also reveal that the downmodulation of CK2 catalytic activity leads to a reduction in Ca++ release from the endoplasmic reticulum stores, and impairs AKT and NF-kB RELA phosphorylation after BCR stimulation. These findings propose a role for CK2 downstream of the BCR engagement, in controlling survival pathways crucial for B-cell endurance. Furthermore, we found out that CX-4945 synergises with inhibitors of kinases, like SYK and BTK, essential in spreading the BCR signal, thus proving that this drug combination enhances DLBCL cell death and could be considered an effective therapeutic strategy.

CK2 è una Ser/Thr chinasi altamente conservata dal punto di vista evolutivo, costituita da due subunità catalitiche (a) e due subunità regolatorie (b) unite a formare un tetramero. Essa è coinvolta in numerosi processi cellulari, tra cui sopravvivenza, proliferazione, differenziamento, risposta al danno al DNA e ad altri stress, portando in definitiva all’attivazione di specifici fattori di trascrizione, come c-Myc ed NF-kB. Questa chinasi è stata trovata sovrespressa in svariati tumori solidi e neoplasie ematologiche, portando ad una correlazione tra alti livelli di CK2 e prognosi sfavorevole. È stato ampiamente dimostrato che CK2 agisce come un potente fattore antiapoptotico nelle cellule tumorali, promuovendo un meccanismo definito “non-oncogene addiction”. In altre parole, l’overespressione e l’aumento dell’attività catalitica dell’enzima contribuiscono notevolmente a creare un ambiente intracellulare favorevole allo sviluppo e al consolidamento di un fenotipo neoplastico. In particolare, è stato recentemente dimostrato che molte neoplasie, derivate dalla trasformazione maligna dei linfociti B, come il mieloma multiplo, il linfoma mantellare e la leucemia linfatica cronica, dipendono da un’aumentata attività di CK2 per il loro mantenimento; infatti, una sua inibizione è in grado di indurre apoptosi cellulare. Il linfoma diffuso a grandi cellule (DLBCL) è una neoplasia di tipo aggressivo derivata dalla trasformazione dei linfociti B nel follicolo ed è il tipo più comune di linfoma non-Hodgkin, rappresentando circa il 40% di tutti i casi. È suddiviso in due sottotipi: uno di derivazione da cellule B del centro germinativo (GCB), l’altro di derivazione da cellule B post centro germinativo (ABC), che sono caratterizzati da differenti alterazioni genetiche e, di conseguenza, da una differente risposta alla terapia. Fino a un terzo dei pazienti non raggiunge la cura con la terapia iniziale e sviluppa una malattia refrattaria o ricade. Il trattamento di salvataggio standard per questi pazienti è il trapianto autologo di cellule staminali, ma il tasso di successo è scarso e la maggior parte di essi non sopravvive alla malattia, dimostrando chiaramente la necessità di nuove terapie di combinazione. È risaputo che il segnale generato dal recettore dell’antigene B (BCR) è in grado di influenzare il differenziamento del linfocita B nella milza e la sua sopravvivenza a livello periferico. In seguito al legame del recettore da parte dell’antigene, il segnale viene trasmesso attraverso la membrana plasmatica e propagato all’interno tramite un gruppo di proteine intracellulari, che si combinano a formare un complesso denominato signalosoma. Tra queste proteine figurano le tirosin chinasi SYK e BTK, la fosfolipasi PLCg2 e l’adattatore BLNK. Una volta attivata da SYK, BTK è in grado di fosforilare PLCg2, che, a sua volta, genera IP3, il quale induce il rilascio di Ca++ dal reticolo endoplasmatico. Il Ca++ agisce nel citoplasma come secondo messaggero, interagendo con varie proteine Ca++-dipendenti, che attivano fattori di trascrizione, come NFAT e NF-kB, modificando, in tal modo, l'espressione genica. Il risultato di questo processo consiste in attivazione, espansione, presentazione dell’antigene e differenziamento del linfocita B. Non sorprende, perciò, che gli inibitori della cascata del segnale del BCR abbiano dimostrato risultati terapeutici promettenti in pazienti con linfomi di tipo B. In questo lavoro di tesi si evidenzia che le subunità a e b di CK2 sono sovrespresse sia in campioni primari, che in linee cellulari immortalizzate di ABC- e GCB-DLBCL, rispetto alle controparti non neoplastiche. Inoltre, si dimostra che l'inibizione di CK2 con CX-4945, un inibitore di CK2 attualmente in trial clinici, provoca l'apoptosi di linee cellulari di DLBCL in maniera dose e tempo dipendente e che l'aumento della morte delle cellule neoplastiche è significativa anche alle dosi di farmaco che non uccidono le cellule normali. Inoltre, l’abbassamento dell’attività catalitica di CK2 porta ad una riduzione del Ca++ rilasciato dal reticolo endoplasmatico, e compromette la fosforilazione di AKT e NF-kB RELA, in seguito a stimolazione del BCR. Questi risultati propongono un ruolo per CK2 a valle del BCR, nel controllo di vie del segnale pro sopravvivenza centrali per il linfocita B. Infine, si evidenzia che il CX-4945 sinergizza con inibitori di chinasi essenziali per la propagazione del segnale del BCR, quali SYK e BTK, provando che questa combinazione di farmaci aumenta la morte delle cellule linfomatose e può considerarsi un’efficace strategia terapeutica.