Identification and functional characterization of components of the OPA1 complexes targeted during apoptotic cristae remodeling

Mitochondria are cellular organelles participating actively in energy production, signal transduction and apoptosis. They are characterized by a sophisticated structure essential for hosting the multiple mitochondrial functions. An outer membrane defines the border of the organelle and the cytoplasm, while an inner membrane compartmentalizes the internal space into intermembrane space, matrix and cristae. Cristae are the sites of oxidative phosphorylation and are separated from the intermembrane space by narrow tubular cristae junctions (Frey and Mannella, 2000; Vogel et al., 2006). During programmed cell death mitochondrial shape and ultrastructure change. These morphological alterations that include the widening of the narrow cristae junctions – the so-called “cristae remodeling” – contribute to the mobilization of the cristae-endowed cytochrome c to the intermembrane space and its complete release to the cytosol (Scorrano et al., 2002). Genetic and biochemical research on the molecular mechanisms of mitochondrial structure modifications during apoptosis unveiled that the inner mitochondrial membrane dynamin-related protein, Optic atrophy 1 (OPA1) is a key regulator of cristae remodeling. OPA1 forms multiple complexes that maintain the cristae junctions close; thereby regulating how much cytochrome c is available in the intermembrane space for release in the cytosol upon permeabilization of the outer mitochondrial membrane. Upon apoptotic stimulus, the high molecular weight (H.M.W) OPA1-containing complexes are disrupted, with concomitant enlargement of the cristae junctions and cytochrome c release (Frezza et al., 2006; Cogliati et al., 2013). Interestingly, these assemblies are composed by the transmembrane (long) and soluble (short) OPA1 forms and their size ranges from 500 to 800 KDa, as judged by blue native gel electrophoresis and by size exclusion chromatography. This size suggests that they contain proteins other than OPA1, whose identity and function calls for investigation. The aim of my PhD thesis is to explore the composition of the OPA1-containing complexes, as well as to characterize the function of identified OPA1 partners in mitochondrial physiology and cell death. Three dimensional BlueNative-BlueNative-SDS PAGE (3D BN-BN-SDS PAGE) followed by semi-quantitative LC/MS analysis of normal and apoptotic mouse liver mitochondria, carried out in our lab, revealed a cohort of candidate proteins present in the OPA1-containing complexes whose distribution changes during programmed cell death. To further mark off the number of candidate OPA1 partners, we additionally performed a semi-quantitative LC/MS analysis in blue native PAGE of mouse heart mitochondria. Furthermore, we employed stable isotope labeling by amino acids (SILAC) (Ong and Mann, 2007) in mouse adult fibroblasts (MAFs), combined with blue native PAGE and LC-MS/MS. In order to distinguish the proteins that are regulated specifically during cristae remodeling, in the two latter approaches we compared a normal mitochondrial population with mitochondrial populations stimulated with the wild type pro-apoptotic caspase 8 cleaved BID (cBIDwt) or a cristae remodeling incompetent mutant of cBID (cBIDKKAA) (Cogliati et al., 2013). The resulted hits of all the three high throughput strategies were analyzed collectively to obtain the final lists of potential OPA1 interactors and the subset of proteins that significantly decrease or increase in the various multimeric OPA1 complexes in the course of cristae remodeling. The discovery of the same OPA1 interactors between the techniques indicated a tissue-independency and that our methods had the level of definition required to inspect OPA1 complexes in cell life and death. Among the identified proteins, our attention was firstly caught by two MICOS complex members: Mic60 and Mic19. “Mitochondrial contact site and cristae organizing system” (MICOS) is a large heterooligomeric protein structure, which regulates cristae junction biogenesis. Nevertheless, the master regulator of cristae shape OPA1 is not part of MICOS and its exact composition, architecture and functions in yeast and mammals are still under active investigation. In all the three proteomic approaches and after immunoblotting of Blue Native PAGE the core component of MICOS, Mic60, was retrieved in high molecular weight complexes with similar electrophoretic mobility as those of OPA1. In order to unravel the potential crosstalk between OPA1 and Mic60, we performed biochemical and genetic analysis in OPA1 or/and Mic60 ablation and demonstrated that the two IMM proteins interact and are indispensable for the Mic60/OPA1 complexes formation. Functionally, electron microscopy revealed that these complexes are essential for cristae junction formation, but not for specifying the width of the cristae lumen or the cristae junction mouth. Moreover, we showed that the Mic60/OPA1 complexes are eliminated by cBIDwt but not by its mutant cBIDKKAA, indicating a novel role of Mic60 that regards apoptotic cristae remodeling. Worth noting, bioinformatics analysis uncovered a structural divergence in the transmembrane and middle domains between yeast and mammalian Mic60 orthologues, potentially explaining the additional Mic60 functions at the outset of evolution. Similarly, we also demonstrated that Mic19 is part of high molecular weight complexes, which are targeted during cristae remodeling, raising the possibility that mammalian Mic19 might also regulate mitochondria biogenesis through the OPA1 pathway. Besides MICOS components, we, additionally, wished to investigate another identified protein that was significantly reduced in apoptosis. This protein is christened nitric oxide-associated 1 (NOA1). The co-existence of NOA1 and OPA1 in the same complexes was confirmed biochemically in BMH crosslinked mitochondria, as well as after co-immunoprecipitation. These initial data, along with the obscure exact function of this newly characterized protein, prompted us to further investigate its role in mitochondria and its relationship with OPA1 in the control of mitochondrial morphology and cristae remodeling. To shed light on the functional link between the two proteins of interest, we used NOA1 deficient MEFs where we surprisingly observed an upregulation of OPA1, both at the protein and at the transcript level. In addition, NOA1 was absent in Opa1-/- MEFs, while its level went back to normal when OPA1 was re-introduced, suggesting a genetic interaction between the two. Next, in order to gain an insight into the role of NOA1 in mitochondria, we analyzed NOA1 deficient MEFs by confocal and electron microscopy. Mitochondria of Noa1-/- cells were fragmented and displayed ultrastructural changes. Interestingly, overexpression of OPA1 corrected the aberrant mitochondrial ultrastructure at a similar extent as upon re-introduction of NOA1, further supporting the hypothesis of an OPA1-NOA1 functional interplay. Given the mitochondrial structural defects, we hypothesized that NOA1 ablation affected also mitochondrial functions. Indeed, Seahorse analysis showed impaired mitochondrial respiration in NOA1 lacking cells, consistent with previously published reports. SDS and blue native PAGE revealed a notable decrease of OXPHOS subunits protein levels and a defect on respiratory complexes assembly in NOA1 deficiency. Remarkably, mtDNA copy number was unaltered, while the protein reduction was not restricted to mtDNA encoded proteins. Consequently, we suggest that the general instability of OXPHOS proteins is probably due to the inability of the respiratory chain complexes to properly assemble, potentially explaining the bioenergetic dysfunction. Functionally, Noa1-/- cells grew slower than WT in galactose-containing medium and after two days they were unable to tolerate glucose deprivation, suggesting a potential role of NOA1 in mitochondrial-dependent cell growth. Due to the fact that OPA1 is an anti-apoptotic protein whose complexes are disrupted after apoptotic stimulation, we aimed to study its partner, NOA1, in the course of apoptosis. Like OPA1, NOA1 complexes that have the same electrophoretic motility after crosslinking as those of OPA1 are similarly disrupted upon cBID induced cristae remodeling. On top of this, during apoptosis, NOA1 is likely proteolyticallly cleaved, which could be a potential mechanism for the elimination of NOA1/OPA1-contining complexes early in cell death stimulation. In conclusion, our study unraveled the composition of OPA1 complexes that are eliminated during apoptosis. We uncovered a crosstalk between the core cristae biogenesis regulators, OPA1 and Mic60, and characterized the role of Mic60 during apoptotic cristae remodeling. Moreover, we discovered a novel player of cristae shape maintenance, cristae remodeling and mitochondrial respiration, NOA1, that acts in the same pathway as OPA1.

I mitocondri sono organelli cellulari che partecipano attivamente alla produzione di energia, la trasduzione del segnale e l'apoptosi. Essi sono caratterizzati da una struttura sofisticata indispensabile per ospitare le molteplici funzioni mitocondriali. Una membrana esterna definisce il confine del organello e il citoplasma, mentre una membrana interna compartimentalizza lo spazio interno in spazio intermembrane, matrice e cristae. Le cristae sono i siti di fosforilazione ossidativa e sono separate dallo spazio intermembrana da strette giunzioni tubolari (Frey and Mannella, 2000; Vogel et al., 2006). Durante la morte cellulare programmata la forma e l’ ultrastruttura mitocondriale cambiano. Queste alterazioni morfologiche che comprendono l'ampliamento delle giunzioni strette delle cristae - il cosiddetto "rimodellamento di cristae" - contribuisce alla mobilitazione del citocromo c, e il suo rilascio completo dallo spazio intermembrana al citoplasma (Scorrano et al., 2002). Ricerche genetiche e biochimiche sui meccanismi molecolari della modificazione mitocondriale durante l'apoptosi hanno svelato che la proteina della membrana mitocondriale interiore, optic atrophy (OPA1) è un regolatore chiave del rimodellamento delle cristae. OPA1 forma vari complessi che mantengono le giunzioni delle cristae regolando così la quantità del citocromo c che è disponibile nello spazio intermembrana per il suo rilascio nel citoplasma dopo la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna. Su stimolo apoptotico, i complessi di alto peso molecolare (high molecular weight, HMW) contenenti OPA1 sono interrotti, con l'allargamento concomitante delle giunzioni e il rilascio del citocromo c (Frezza et al., 2006; Cogliati et al., 2013). È interessante notare che questi gruppi sono composti da forme transmembrana (lunghe) e forme solubili (corte) di OPA1 e la loro dimensione è compresa tra i 500 e gli 800 KDa, come giudicato da elettroforesi su gel blu nativo e per dimensione cromatografia di esclusione. Questa dimensione suggerisce che essi contengono anche altre proteine oltre che OPA1, la cui identità e funzione deve essere esaminata. Lo scopo della mia tesi di dottorato è di esplorare la composizione dei complessi-OPA1 contenenti, e di caratterizzare la funzione delle parti di OPA1 identificate nella fisiologia mitocondriale e nella morte cellulare. Elettroforesi tridimensionale su gel di poliacrilammide blu nativo (BN-PAGE) (3D BN-BN-SDS PAGE) seguita da semi-quantitativa LC/MS analisi di mitocondri normali e apoptotici di fegato di topo, effettuata nel nostro laboratorio, ha rivelato una coorte di proteine putative presenti nei complessi OPA1–contenenti la cui distribuzione cambia durante la morte cellulare programmata. Per identificare meglio i partner putativi per OPA1 abbiamo inoltre eseguito un semi-quantitativa LC/MS analisi in su gel BlueNative dei mitocondri murini cardiaci. Inoltre, abbiamo impiegato etichettatura a isotopo stabile con aminoacidi (SILAC) (Ong and Mann, 2007) in fibroblasti di topo adulto (MAFS), in combinazione con 2D BN-BN PAGE e LC/MS. Per distinguere le proteine che sono regolate particolarmente durante il rimodellamento delle cristae, con questi due approcci abbiamo confrontato la popolazione mitocondriale normale con le popolazioni mitocondriali stimolate con BID, un fattore pro-apoptotico tagliato proteoliticamente dal caspasi 8, in forma wild type (cBIDwt) o con mutazione che compromette il rimodellamento delle cristae (cBIDKKAA) (Cogliati et al., 2013). I risultati ottenuti dalle tre strategie high throughput sono stati analizzati per ottenere gli elenchi definitivi dei potenziali interattori di OPA1 e il coorte delle proteine che sono ridotte o aumentate in modo significativo nei vari complessi multimerici di OPA1 durante il rimodellamento delle cristae. La scoperta degli stessi interattori di OPA1 con le varie tecniche hanno dimostrato indipendenza dal tipo di tessuto, cosa che mostra che i nostri metodi hanno il livello di specificità necessario per l’ ispezione dei complessi OPA1 nella vita e morte cellulare. Tra le proteine identificate, la nostra attenzione è stata catturata da due componenti del complesso MICOS: Mic60 e Mic19. Il “Mitochondrial contact site and cristae organizing system” (MICOS) è una grande struttura proteica eterooligomerica, che regola la biogenesi delle giunzioni delle cristae. Tuttavia, il regolatore principale delle cristae OPA1 non fa parte del complesso MICOS e la sua esatta composizione, l'architettura e le funzioni nel lievito e nei mammiferi sono ancora sotto esame. In tutti e tre gli approcci di proteomica e dopo immunoblotting con gel Blue Native, il componente principale di MICOS, Mic60, è stato individuato in complessi ad alto peso molecolare con simile mobilità elettroforetica a quelli di OPA1. Al fine di svelare il potenziale crosstalk tra OPA1 e Mic60, abbiamo effettuato analisi biochimiche e genetiche in situazione di ablazione di OPA1 o/e Mic60 e dimostrato che le due proteine interagiscono nelle membrane mitocondriali interne (inner mitochondrial membranes-IMM) e sono essenziali nella formazione dei complessi OPA1/Mic60. Esperimenti di microscopia elettronica hanno rivelato che questi complessi sono essenziali nella formazione della giunzione delle cristae, ma non per specificare la larghezza del loro lumen o la giunzione del loro foro. Inoltre, abbiamo dimostrato che i complessi Mic60/OPA1 sono eliminati da cBIDwt ma non dal suo mutante cBIDKKAA, indicando un nuovo ruolo di Mic60 che riguarda il rimodellamento apoptotico delle cristae. E’ da notare che l'analisi bioinformatica ha mostrato una divergenza strutturale tra gli ortologi di Mic60 tra lievito e mammiferi, spiegando potenzialmente le ulteriori funzioni Mic60 sin dall'inizio dell'evoluzione. Allo stesso modo, abbiamo anche dimostrato che Mic19 fa parte di complessi ad alto peso molecolare presenti durante la ristrutturazione delle cristae, aumentando la possibilità che il Mic19 dei mammiferi potrebbe anche regolare la biogenesi dei mitocondri attraverso il pathway di OPA1. Oltre ai componenti di MICOS, abbiamo voluto, inoltre, indagare un'altra proteina trovata significativamente ridotta durante l’ apoptosi. Questa proteina è chiamata ossido nitrico-associato 1 (nitric oxide-associated 1, NOA1). La coesistenza di NOA1 e OPA1 negli stessi complessi è stata confermata con metodi biochimici in BMH mitocondri crosslinked, così come dopo co-immunoprecipitazione. Questi dati iniziali, insieme al fatto che la funzione di questa proteina era all’ oscuro sino ad ora, ci hanno spinto a studiare ulteriormente il suo ruolo nei mitocondri e la sua relazione con OPA1 nel controllo della morfologia mitocondriale e nel rimodellamento delle criste. Per far luce al collegamento funzionale tra le due proteine di interesse, abbiamo utilizzato MEF carenti di NOA1 dove abbiamo sorprendentemente osservato un aumento di OPA1, sia a livello di proteine che a livello di trascrizione. Inoltre, mentre NOA1 era assente nelle Opa1-/- MEF, il suo livello è tornato alla normalità quando è stata reintrodotta OPA1, suggerendo un interazione genetica tra le due. Successivamente, al fine di ottenere informazioni sul ruolo di NOA1 nei mitocondri, abbiamo analizzato Noa1-/- MEF mediante microscopia confocale ed elettronica. I mitocondri di cellule Noa1-/- sono frammentati e hanno alterazioni ultrastrutturali. È interessante notare che l' iperespressione di OPA1 ha corretto l’ ultrastruttura mitocondriale aberrante in misura simile a quella di reintroduzione di NOA1, sostenendo ulteriormente l'ipotesi di una interazione funzionale OPA1-NOA1. Dati i difetti strutturali mitocondriali, abbiamo ipotizzato che l’ ablazione di NOA1 colpisca anche funzioni mitocondriali. Infatti, analisi Seahorse ha mostrato una respirazione mitocondriale compromessa in cellule mancanti NOA1, coerente con quello che era già stato pubblicato. Analisi SDS e Blue Native hanno rivelato una notevole diminuzione nei livelli delle proteine delle varie subunità di OXPHOS e un difetto nel assemblaggio dei complessi respiratori mancanti NOA1. Sorprendentemente, il numero di copie di DNA mitocondriale (mtDNA) era inalterato, mentre la riduzione della proteina non era limitata alle proteine codificate da DNA mitocondriale. Di conseguenza, si suggerisce che l'instabilità generale delle proteine OXPHOS è probabilmente dovuta all’ incapacità dei complessi della catena respiratoria ad essere assemblati correttamente, potenzialmente spiegando le disfunzioni bioenergetiche. Funzionalmente, le cellule Noa1-/- crescevano più lentamente rispetto a quelle WT con medio contenente galattosio, e dopo 2 giorni non erano in grado di tollerare deprivazione di glucosio, suggerendo un ruolo potenziale di NOA1 nella crescita cellulare dipendente da mitocondri. A causa del fatto che OPA1 è una proteina antiapoptotica e i suoi complessi sono interrotti dopo stimoli apoptotici, abbiamo voluto studiare il suo partner, NOA1, nel corso dell’ apoptosi. Come per OPA1, i complessi di NOA1 che hanno la stessa motilità elettroforetica dopo crosslink come quelli di OPA1 sono similmente interrotti su rimodellamento delle criste indotto da cBID. Oltre a ciò, durante l'apoptosi, è probabile una scissione proteolitica di NOA1, che potrebbe essere un potenziale meccanismo per l'eliminazione di complessi NOA1-OPA1 subito dopo la stimolazione della morte cellulare. In conclusione, il nostro studio ha svelato la composizione dei complessi OPA1 che vengono eliminati durante l'apoptosi. Abbiamo scoperto un crosstalk tra i principali regolatori della biogenesi delle cristae, OPA1 e Mic60 e caratterizzato il ruolo di Mic60 durante il rimodellamento apoptotico delle cristae. Inoltre, abbiamo scoperto un nuovo giocatore nella manutenzione della forma delle cristae, nel loro rimodellamento e nella respirazione mitocondriale, NOA1, che agisce nello stesso pathway di OPA1.