REGULATION OF MITOCHONDRIAL Ca2+ UPTAKE: ROLE OF CCDC90A AND CCDC90B

Intracellular signaling requires rapid and efficient changes in the intracellular concentration of messengers through time. One of most important second messenger is Calcium. Mitochondria are important component in intracellular signaling and Ca2+ is one of the key regulators of organelle physiology. Its uptake inside the organelle is driven by the potential across the inner mitochondrial membrane, through a selective ion channel, called Mitochondrial Calcium Uniporter (MCU) (De Stefani, D., et al., Nature (2011); Baughman, J.M., et al., Nature (2011)). Ca2+ plays a pleiotropic role into mitochondria, ranging from the regulation of ATP production, to the shaping of cytoplasmic Ca2+ waves and activation of apoptosis (Rizzuto, R., et al., Nat Rev Mol Cell Biol (2012)). MCU is the core element of the so-called “MCU complex”. Several pathological conditions are directly or indirectly linked to mitochondrial dysfunction, and the molecular characterization of the MCU complex, that is responsible for the highly selective transport of Ca2+ across the inner mitochondrial membrane, gives the opportunity to modulate mitochondrial function by modifying MCU channel activity. The mechanism by which Ca2+ is transported into mitochondria has been unclear for a long time and several proteins have been identified in the past years. We now know that the MCU complex is formed by MCU, the selective channel that allows Ca2+ entry into the matrix, its dominant negative isoform MCUb, the Essential MCU REgulator (EMRE) and two channel modulators, Mitochondrial Calcium Uptake 1 and Mitochondrial Calcium Uptake 2 (MICU1 and MICU2) (De Stefani, D. and Rizzuto,R., Biochem Biophys Res Commun (2014)). Recently, another regulator was discovered and named MCU Regulator 1 (MCUR1). MCUR1 down regulation causes a decrease in agonists-induced mitochondrial calcium transients; moreover, MCUR1 is able to bind MCU but not MICU1, thus suggesting that MCU may exists in two different complexes, one with MCUR1 and another one with MICU1 (Mallilankaraman, K., et al., Nat Cell Biol (2012)) . We found that MCUR1 (formerly known as CCDC90A) has also an isoform, named CCDC90B, whose function is still totally unknown. This work is thus focused on the role of these two proteins in the regulation of the MCU complex activity. We found that both MCUR1 and CCDC90B are integral proteins of the inner mitochondrial membrane, they are broadly expressed among tissues, and CCDC90B mRNA is generally present at higher levels than MCUR1. From the functional point of view, silencing of MCUR1 or CCDC90B leads to a decrease of mitochondrial calcium influx. However, we could detect only a marginal functional interaction between these two proteins and the other components of the MCU complex. Accordingly, the down regulation of both these proteins decreases mitochondrial membrane potential. Overall our data suggest that MCUR1 and its isoform CCDC90B have an indirect effect on mitochondrial calcium uptake, due to a mechanism that we are currently addressing and could depend on the assembly of ETC complexes (Paupe, V., et al., Cell Metabolism (2015)).

I meccanismi di trasduzione di segnali intracellulari richiedono cambiamenti rapidi ed efficienti della concentrazione di molecole segnale nel tempo. Uno dei più importanti secondi messaggeri è il Calcio (Ca2+). I mitocondri sono fondamentali nella segnalazione intracellulare e il Ca2+ è a sua volta un elemento chiave della fisiologia di questi organelli. L’accumulo di Ca2+ all’interno dei mitocondri è guidato dal potenziale di membrana (Ψm), attraverso un canale ionico selettivo chiamato Mitochodrial Calcium Uniporter (MCU) (De Stefani, D., et al., Nature (2011); Baughman, J.M., et al., Nature (2011)). Il Ca2+ svolge un ruolo pleiotropico nei mitocondri, che va dalla regolamentazione della produzione di ATP, al controllo delle onde di Ca2+ citoplasmatico fino all’attivazione dell’apoptosi cellulare (Rizzuto, R., et al., Nat Rev Mol Cell Biol (2012)). MCU è l’elemento principale dell’omonimo complesso denominato “complesso MCU”. Diverse condizioni patologiche sono direttamente o indirettamente legate a disfunzioni delle funzioni mitocondriali. La caratterizzazione molecolare del complesso di MCU, responsabile del trasporto selettivo degli ioni Ca2+ attraverso la membrana mitocondriale interna (IMM), offre la possibilità di modulare l’attività del canale MCU, fondamentale per la funzione signaling mitocondriale. Il meccanismo con il quale lo ione Ca2+ è trasportato all’interno dei mitocondri è tuttavia rimasto un mistero per molto tempo. Negli ultimi anni di ricerca diverse proteine sono state identificate come parte del complesso di MCU. Attualmente i protagonisti nell’attività di uptake di Ca2+ nel mitocondrio sono: MCU, il canale selettivo che permette l’accesso esclusivo agli ioni Ca2+ nella matrice mitocondriale; la sua isoforma MCUb, che svolge un effetto dominante negativo sull’attività del canale; EMRE, un regolatore essenziale di MCU e infine i due modulatori del canale MICU1 e MICU2, rispettivamente acronimi di Mitochondrial Calcium Uptake 1 e 2 (De Stefani, D. e Rizzuto, R., Biochem Biophys Res Commun (2014)) . Recentemente è stato scoperto un nuovo regolatore, chiamato MCU Regulator 1 (MCUR1). È stato provato che la riduzione dell’espressione di MCUR1 causa una rilevante riduzione della concentrazione di Calcio nella matrice mitocondriale. È inoltre riportato che MCUR1 è fisicamente legato a MCU, ma non presenta alcuna interazione fisica con MICU1, suggerendo la possibile esistenza di due tipologie di complessi MCU: uno con MICU1 e un altro con MCUR1, ma non con entrambi simultaneamente (Mallilankaraman, K., et al., Nat Cell Biol (2012)). In questo lavoro di ricerca è stato scoperto che MCUR1, conosciuto anche come CCDC90A, possiede un’isoforma, nota col nome di CCDC90B, e sua funzione è attualmente ancora sconosciuta. Pertanto abbiamo focalizzato la nostra attenzione su queste due proteine e la loro possibile funzione nel complesso di MCU. Entrambe le proteine, CCDC90A e CCDC90B, risiedono nella membrana mitocondriale interna, e sono espresse in tutti i tessuti umani. In particolare, in molti di essi l’mRNA di CCDC90B è generalmente presente in quantità superiore rispetto a CCDC90A. Dal punto di vista funzionale, il silenziamento di entrambe le proteine causa una diminuzione del flusso di Ca2+ mitocondriale. Tuttavia, entrambe le proteine hanno dimostrato solo una minima interazione funzionale con gli altri componenti del complesso di MCU. Inoltre, il silenziamento di CCDC90A e CCDC90B causa una significativa depolarizzazione del potenziale di membrana mitocondriale. Complessivamente, i dati raccolti in questo lavoro suggeriscono che sia CCDC90A che la sua isoforma CCDC90B hanno un effetto indiretto sull’accumulo mitocondriale di Ca2+. Probabilmente, questo effetto è correlato all’azione che queste due proteine potrebbero svolgere nell’assemblaggio dei complessi della catena di trasporto degli elettroni (mETC) (Paupe, V., et al., Cell Metabolism (2015)).