Improving key root traits in sugar beet: Fusarium resistance

The challenge of the twenty-first century is to produce enough food to meet population demands without extending land or damaging the environment. Combining a maximum number of desirable traits such disease resistance, greater yield, and high quality is a desirable goal for plant breeders. The development of resistant crop genotypes is essential to ensure global food security, make the plant more useful and avoid crop losses. The development of molecular markers linked to the target traits is needed to predict phenotypic variation based on genotype. Marker-Assisted Selection (MAS) can reduce costs and the time required to obtain new cultivars by comparing selection only based on phenotypic evaluation. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are widely used as genetic marker. Sugar beet (Beta vulgaris L.) is the second source of world sugar supply and is grown in all temperate zones. The crop is attacked by many pathogens and among these, the soil-borne fungus Fusarium oxysporum causes severe sugar beet damages. Two different formae speciales have been reported in sugar beet, F. oxysporum f. sp. betae that causes Fusarium yellows, and F. oxysporum f. sp. radicis-betae that causes Fusarium root rot. Disease symptoms are characterized by wilt and yellow leaves that normally die as the disease progresses. Internal symptoms consist of a brown or grey brown vascular discoloration and in the case of root rot, there is a back external rot in the primary root. Sugar beet varieties are susceptible to F. oxysporum, which can cause a lower root yield and reduce sugar quality. No genetic studies have been done up to now, so no genes or quantitative trait loci (QTLs) conferring resistance to F. oxysporum in sugar beet have been reported. The aims of this work were (i) to investigate the response of a wide collection of sugar beet lines to F. oxysporum f. sp. betae, (ii) to identify resistant lines suitable for future breeding efforts and (iii) to discover molecular markers linked to the Fusarium resistance that could be considered for use in marker-assisted selection (MAS) programs. The first part of the thesis is a literature review of sugar beet breeding achievements, including the discovery of monogermity and cytoplasmic-genetic male sterility (CMS) that allowed the release of hybrid varieties. The review also focused on the breeding progresses against diseases obtained with classical and molecular methods using sources of resistance from wild beets. Next-generation sequencing (NGS) technologies with the recent release of the full sugar beet genome sequence are also reported. Incorporation of genomics into conventional sugar beet breeding programs is essential to obtain important yield achievements in sugar beet. The second part was aimed at screening a wide range of sugar beet lines to identify the different effect to F. oxysporum f. sp. betae inoculation and to select resistant and susceptible lines. To achieve this, 29 sugar beet lines were screened under greenhouse conditions with two highly virulent isolates belonging to different genetic sub-groups. The third part regards an experiment conducted to evaluate the response of different sugar beet breeding germplasm to isolates of F. oxysporum f. sp. betae. In the previously tested lines, an unusual root rot was observed, normally reported in cases of infection with F. oxysporum f. sp. radicis-betae. Eight susceptible lines, from USDA-ARS (US) and UNIPD (University of Padova, Italy), were inoculated with three different isolates of F. oxysporum f. sp. betae, the causal agent of Fusarium yellows. All inoculated lines developed disease symptoms, but severe root rot was observed only in the susceptible UNIPD lines inoculated with isolates that had never caused root rot in the USDA germplasm. In this work, an unusual root rot was reported for the first time that seems to be caused not only by the isolates, but is also due to a germplasm effect. The fourth part was aimed to identify molecular SNP markers linked to the Fusarium resistance in sugar beet. A candidate gene approach was used on susceptible and resistant lines to achieve this goal. Five resistant gene analogues were screened by means of a high-resolution melting (HRM) analysis and two allelic variants, within two genes, were significantly associated to Fusarium resistance. Sanger sequencing allowed the discovery of two SNP markers linked to the resistance. These two SNPs were significantly associated with the resistance and were mapped on the exon of Bv7_171470_ojty and Bv2_043450_zhxk, respectively.

Il miglioramento genetico delle piante coltivate, basato sull’esplorazione, sull’utilizzo delle risorse genetiche e sulla ricerca genomica avanzata, è prioritario per soddisfare il fabbisogno alimentare di una popolazione mondiale in costante crescita. In particolare, l’introgressione di tratti desiderabili come la resistenza alle malattie e la maggior resa produttiva è fondamentale per garantire la sicurezza alimentare a livello globale. Per accelerare il miglioramento delle piante è essenziale predire le variazioni fenotipiche sviluppando marcatori molecolari legati ai tratti in esame. La selezione assistita da marcatori molecolari può ridurre costi e tempi di ottenimento di nuove varietà rispetto alla selezione basata solo su variazioni fenotipiche. Fra i marcatori molecolari disponibili, le mutazioni di singola base (SNP) sono i più diffusi. La barbabietola da zucchero (Beta vulgaris L.) è la seconda fonte di zucchero al mondo ed è coltivata in tutte le aree temperate. La coltura è colpita da numerosi patogeni e, fra questi, il fungo Fusarium oxysporum causa severi danni. Due differenti forme speciali di Fusarium, Fusarium oxysporum f. sp. betae (Fusarium yellows) e Fusarium oxysporum f. sp. radicis-betae (Fusarium root rot) sono state identificate in barbabietola. La malattia è caratterizzata da avvizzimento e clorosi fogliare con un progressivo deperimento delle foglie, spesso seguito dalla morte dell’intera pianta. I sintomi interni consistono in una discolorazione vascolare con imbrunimento dei fasci vascolari e, nel caso di marciume radicale, è presente un caratteristico annerimento all’esterno della radice principale. Per il controllo del patogeno, l’impiego di fungicidi e le rotazioni colturali non sono efficaci. L’introgressione di geni di resistenza dal germoplasma selvatico è ritenuta la strategia principale per la difesa della coltura. Questo richiede lo sviluppo di marcatori molecolari legati ai geni di resistenza per la selezione assistita degli individui resistenti. Gli obiettivi del lavoro di tesi sono stati i seguenti: (i) valutare la risposta a Fusarium oxysporum f. sp. betae di un’ampia collezione di linee di barbabietola da zucchero (ii) identificare linee resistenti a Fusarium oxysporum da poter utilizzare in futuri programmi di miglioramento genetico e (iii) identificare marcatori molecolari SNP (polimorfismi del DNA a singolo nucleotide) legati alla resistenza a Fusarium da utilizzare in programmi di selezione assistita da marcatori. Il primo contributo del lavoro di tesi descrive lo stato dell’arte dei risultati ottenuti nel miglioramento genetico della barbabietola da zucchero. Il contributo si focalizza sui progressi ottenuti nella resistenza a malattie con metodi di miglioramento genetici classico e con l’impiego di tecniche molecolari utilizzando come fonte di resistenza germoplasma selvatico. E’ stato inoltre considerato il contributo delle nuove tecnologie di sequenziamento e del recente rilascio del genoma di riferimento al miglioramento genetico della barbabietola. Il secondo contributo riguarda la valutazione della risposta a Fusarium oxysporum f. sp. betae di un’ampia collezione di linee di barbabietola da zucchero al fine di identificare linee resistenti e suscettibili. Per raggiungere questo scopo sono state esaminate 29 linee di barbabietola da zucchero. Le piante sono state infettate con due isolati fungini F19 e Fob220a, appartenenti a due gruppi genetici distinti, entrambi altamente patogenici. Dopo l’inoculo, per un periodo di sei settimane, è stato attribuito, per ciascuna pianta, un punteggio da 0 a 5 in base ai vari sintomi di malattia manifestati, quali: avvizzimento fogliare, clorosi e necrosi. Successivamente, le piante sono state raccolte e le radici sono state esaminate per vedere dove era presente marciume radicale, discolorazione e quali piante invece risultavano resistenti al patogeno. Il terzo contributo descrive la risposta di due diverse collezioni di germoplasma di barbabietola da zucchero a isolati di Fusarium oxysporum f. sp. betae. Linee suscettibili, provenienti da USDA-ARS (US) e UNIPD (Università di Padova, Italia), sono state inoculate con tre distinti isolati di Fusarium oxysporum f. sp. betae, l’agente causa di Fusarium yellows. Tutte le linee inoculate hanno sviluppato i sintomi della malattia, ma un grave marciume radicale è stato osservato solo nelle linee provenienti da UNIPD inoculate con isolati che non avevano mai causato marciume radicale nel germoplasma USDA. Il quarto contributo riguarda l’identificazione, su geni candidati, di marcatori molecolari SNPs associati alla resistenza alla malattia. In particolare, sono stati identificati 5 analoghi a geni di resistenza (RGA) dal lavoro di Dohm et al. 2014 e sono stati analizzati tramite analisi High Resolution Melting (HRM) su 96 campioni delle 6 linee più resistenti e più suscettibili a Fusarium. Due varianti, in 2 dei geni testati, sono risultate significativamente associate (p < 0.01) con la resistenza a Fusarium. Le varianti sono state validate attraverso sequenziamento Sanger. Il sequenziamento ha permesso di individuare due marcatori SNPs. L’associazione tra questi due SNPs e la resistenza a Fusarium è stata successivamente validata con il metodo di genotipizzazione Comparative allele-specific PCR (KASPar) su 96 campioni resistenti e 96 campioni suscettibili. La frequenza dell’allele A sia per lo SNP_Bv7_171470 e lo SNP_Bv2_043450 è risultata significativamente più alta negli individui resistenti rispetto a quelli suscettibili. Questi due SNPs potranno essere utilizzati in programmi di selezione genetica al fine di migliorare la resistenza a Fusarium in barbabietola da zucchero.