Comparative molecular targets for anticancer chemotherapy: new insights and perspectives

The past thirty years have reported the introduction of multiple anticancer therapies targeting various aspects of the cancer hallmarks, which are essential for successful tumor propagation and dissemination. In this sense, the evolution of molecular-scale technology has been central to the identification of new cancer targets. The receptor tyrosine kinase (RTK) Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma virus homolog (c-KIT) is a critical regulator of growth, differentiation, migration and proliferation in the hematopoietic system, in germ cells and melanocytes. Since it activates a number of intracellular signaling pathways implicated in the tumor progression, it is one of the most studied proto-oncogenes as well as the target of drugs belonging to the family of tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Actually, TKIs are employed for the treatment of human and canine c-KIT-dependent tumors as an alternative to standard chemotherapy. Nevertheless, multiple resistance phenomena frequently occur. Recently, the discovery of G-quadruplex (G4) structures highlighted a new role for DNA in cancer biology. DNA G4 are four-stranded globular nucleic acid secondary structures, formed in specific G-rich sequences with biological significance; among these ones, the human telomeres and the promotorial region of oncogenes such as c-KIT. In the first part of this dissertation, three compounds were proved to bind in silico c-KIT G4 and were tested in human and canine cell lines to check for their potential usefulness as therapeutic agents. Interesting results, e.g. c-KIT mRNA and protein inhibition, were obtained with an anthraquinone derivative (AQ1) that caused a block of cell proliferation. In another study, the occurrence of c-KIT mutations was investigated in matched primary and metastatic canine cutaneous mast cell tumor (MCT), to make a recommendation for the best therapeutic choice. In dogs, 10-30% of MCTs possess c-KIT mutations, and the relevance of the mutational status for the therapy with TKIs is nowadays accepted also in this species; however, little is known on c-KIT mutational status in metastatic MCTs. In all analyzed dogs, there was a perfect concordance between c-KIT mutational status in primary MCT and the relative lymph node metastasis. This has a relevant implication for clinical practices. Finally, during the Ph.D. program, a collaboration was established with the Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, and particularly with Dr. Patrice Dubreuil. In his most recent articles, he discovered a set of genes that are frequently mutated in human systemic mastocytosis (SM) and cooperate with c-KIT in the disease malignant evolution. In the last study illustrated in this Ph.D. thesis, the mutational profile of these hotspot genes in canine MCTs samples has been screened, in order to find molecular similarities between the two diseases, thereby justifying the use of domestic dog as an animal model in comparative oncology.

Negli ultimi trent’anni, l’evoluzione delle tecnologie in campo medico-scientifico ha permesso la più profonda conoscenza dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo, della crescita e della diffusione del tumore. Tutto ciò ha permesso di sviluppare le cosiddette terapie mirate, identificando nuovi bersagli terapeutici. Il recettore tirosin-chinasico c-KIT è un fattore critico per la regolazione della crescita, differenziazione, migrazione e proliferazione delle cellule germinali, di quelle del sistema ematopoietico e dei melanociti. c-KIT è anche coinvolto nell’attivazione di numerosi meccanismi intracellulari implicati nella progressione tumorale e, allo stesso tempo, è uno dei proto-oncogeni più studiati ed il bersaglio di farmaci appartenenti alla famiglia degli inibitori tirosin-chinasici (TKIs). Attualmente, i TKIs sono approvati come trattamento alternativo alla chemioterapia tradizionale in tumori c-KIT dipendenti in uomo e cane tuttavia, fenomeni di resistenza a questi farmaci si verificano frequentemente. Negli ultimi anni, la scoperta di strutture secondarie del DNA chiamate G-quadruplex (G4) ha evidenziato un nuovo ruolo degli acidi nucleici nella biologia tumorale. Tali conformazioni si formano in specifiche sequenze del DNA ricche in residui di guanina, localizzate principalmente nei telomeri e nelle regioni promotoriali di alcuni oncogeni come c-KIT. Nella prima parte di questa tesi di dottorato, tre composti scelti sulla base della loro capacità di legare e stabilizzare le conformazioni G4 sono stati testati in linee cellulari stabilizzate di uomo e cane al fine di determinare la loro efficacia come potenziali agenti terapeutici. In questo senso, alcuni risultati interessanti in termini di blocco della proliferazione nonché della trascrizione e traduzione di c-KIT si sono ottenuti con un derivato della famiglia degli antrachinoni chiamato AQ1. In un altro studio proposto, il profilo mutazionale di c-KIT è stato analizzato in una coorte di campioni di mastocitoma del cane composti da tumore primitivo e relativa metastasi linfonodale. Nel cane infatti, la percentuale tra il 10 ed il 30% dei mastocitomi presenta almeno una mutazione di c-KIT nel tumore primitivo, tuttavia, poche conoscenze si hanno relativamente al profilo mutazionale nelle metastasi. Dai risultati ottenuti, tutti i cani analizzati hanno dimostrato avere una perfetta concordanza tra tumore primitivo e metastasi in termini di status mutazionale di c-KIT con rilevanti implicazioni cliniche per la scelta della miglior terapia da attuare da parte degli oncologi veterinari. Infine, nel corso del secondo anno di dottorato, è nata una collaborazione con il Dr. Patrice Dubreuil del Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, a Marsiglia. Nei suoi recenti articoli sulla mastocitosi dell’uomo, egli ha scoperto un set di geni che presentano mutazioni in talune percentuali di casi e cooperano con c-KIT nello sviluppo delle forme più gravi ed aggressive della malattia. Nell’ultima pubblicazione illustrata in questa dissertazione, è stato eseguito lo screening del profilo mutazionale di questi nuovi geni in campioni di mastocitoma di cane al fine di trovare analogie molecolari che possano giustificare l’uso del cane come animale modello nell’oncologia comparata.