Definition of the pharmacological profile of conventional chemotherapeutic drugs based on pharmacogenetics determinant in CRC patients

Abstract Cancer patients do not always respond in the same way to the same drug treatment: the administration of the same dose of an antiblastic drug in a population of patients induces the manifestation of a wide range of toxicity, which sometimes can even be deadly. The intersubject variation, that is observed in efficacy and toxicity of anticancer drugs, can be determined by complex interactions among components of the physiological, environmental and genetic factors. The activities carried out in the framework of the PhD project have focused the attention on the influence of genetic factors on the outcome of drug treatment, identifying possible prognostic and predictive genetic biomarkers. To evaluate the correlation between genotype and phenotype of the patient, we considered a pharmacogenetics study which defined the relationship between a specific polymorphism (UGT1A1 * 28) and the effects of the drug. A phase Ib clinical trial was conducted at the CRO, Aviano (PN). The purpose of this study was to modulate the dosage of CPT-11 in the presence of the inhibitor angiogenetic BV for each individual patient, based on genotype of UGT1A1, in order to obtain an improvement of the therapeutic index . To do this, it was considered necessary to develop a specific method of pharmacokinetic analysis and we proceeded as follows : * Development of a quantitative method for the analysis of the drug of interest * Validation of the method in accordance with FDA guidelines * Measurement of plasma concentrations of the drug * Determination of the pharmacokinetics of the drug * Correlation of pharmacokinetics and pharmacogenetics We enrolled patients with a histological diagnosis of metastatic colorectal adenocarcinoma, naïve or treated with adjuvant chemotherapy (excluding irinotecan), and corresponding to the criteria for eligibility/exclusion described in the protocol. The patients were assigned to their treatment group based on genotype (*1/*1 or *1/*28) until the completion of recruitment for each dose level in each group of patients. Patients with genotype *28/*28 were excluded because of high risk of toxicity. The starting dose of irinotecan administered in patients carrying the *1 (wild-type and heterozygous) was 260mg/m2. The dose of BV was 5mg/kg and it was administered in infusion after two weeks. In the treatment group with lower dose, the irinotecan dose was increased to 310 and 370mg/m2 in case of lack of toxicity. The evaluation of pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions between bevacizumab (BV) and irinotecan (CPT-11) was conducted describing the pharmacokinetic profile of the CPT -11 (and its metabolites) in the absence and in the presence of BV in the same patient. The obteined pharmacokinetic parameters exclude an effect of BV on the pharmacokinetics of CPT-11. However, the registered values ??of MTD were lower than those determined by previous works with FOLFIRI alone, and that might suggest that the addition of BV results in changes in the manifestation of toxicity in the high-dose regimens. The drugs that have been investigated in this protocol have been present in the clinical practice since several years, and the high variability of the response and toxicity makes it essential the definition of useful criteria for treatment personalization. Basic criteria for personalization of therapy are clinical parameters, like gender and age of the patients. Many of the elderly subjects, in fact, receive reduced treatments comparing standard clinical protocols, with a considerable reduction of the dosage of the drug or of the number of therapy cycles. Due to their physiological characteristics, the older cancer patients reported greater toxicity effects associated with the treatment. In clinical trials, elderly patients are under-represented because they don’t satisfy all the inclusion criteria, like comorbid conditions and baseline functional status of the patient. Similarly, women are often excluded from some protocols especially for the variability that characterizes the hormonal status. In a second part of the PhD project, we considered a very large series of patients with CRC treated with other medications associated with fluoropyrimidine (FOLFOX or FOLFIRI) at the CRO, Aviano (PN), and other centers participating in the program. We performed a pharmacogenetic study to see if there are genetic biomarkers useful to define a personalization of therapy for subjects considered elderly (age at diagnosis >70 years). In particular, the aim was to identify possible pharmacogenetic (PG) determinants which influence drug effects (toxicity and response) in a different way between young and elderly subjects, and between the two genders (male and female). We analyzed several polymorphisms of genes coding for proteins involved in the mechanisms of activation, metabolism and elimination of drugs mainly used in therapies against CRC and other polymorphisms in genes that regulate the cell cycle and involved in the process of carcinogenesis and tumor progression. Many allelic variations confirm an association with the risk of developing cancer risk, while others with the survival of patients. In particular, the variation in the copy number of GSTM1 and GSTT1 genes, showed a correlation with the age of diagnosis of the patients, as well as with the gender. The increase in copies of GSTM1 or GSTT1 reduction are associated with greater survival in male patients older than 70 years (PGSTM1=0.047, HR=3.937, 95% CI=0.89-0:31; PGSTT1=0.039, HR=4.246). Moreover, we further found a specific association of genotype GSTnull with an increased risk of tumor in young subjects, but not in the elderly. It can therefore be assumed that there is a deficiency in the enzymatic activity of glutathione S-transferase deficiency resulting in reduced cell detoxification mechanisms that involve an increase in damage to the DNA damnage. Additional data allowed us to conclude that genetic characteristics may be associated with both gender and age of the patients: there are polymorphisms predictive of risk related to one of the two parameters (MTHFR 1298A>C in young women); polymorphisms localized in repair genes are mainly associated with a greater risk and a lower survival in the elderly population. Translational research is a fundamental step for the application of experimental research to clinical practice. One of the most important aspects in this area is the customization of the therapy that should be considerate important to get treatment optimization especially in the field of oncology.

Riassunto Pazienti oncologici, con lo stesso tipo di tumore, non sempre rispondono in modo uguale al medesimo trattamento farmacologico: la somministrazione della stessa dose di un dato farmaco antiblastico in una popolazione di pazienti implica spesso la manifestazione di un vasto range di tossicità, che in alcuni casi può risultare addirittura mortale. La variabilità intersoggettiva che si osserva nell’efficacia e nella tossicità dei farmaci antiblastici impiegati nella chemioterapia può pertanto essere determinata da interazioni complesse tra le componenti fisiologiche, ambientali e fattori genetici individuali. L’attività svolta in ambito del progetto di dottorato ha puntato l’attenzione su come i fattori genetici possano influenzare l’esito di un trattamento farmacologico, individuando dei possibili biomarcatori genetici prognostici e predittivi. Per valutare la correlazione tra genotipo e fenotipo del paziente siamo partiti da uno studio di farmacogenetica che ha definito la relazione esistente tra un determinato polimorfismo (UGT1A1*28) e l’alterazione dell’effetto del farmaco che ne consegue. Successivamente, ci si è indirizzati verso il trasferimento e l’applicazione nella pratica clinica attraverso uno studo clinico di fase Ib (“Studio di fase I guidato dal genotipo dell’irinotecano in combinazione con 5-fluorouracile/leucovorina (FOLFIRI) e bevacizumab in pazienti con carcinoma colonrettale”), condotto presso il Centro di Riferimento Oncologico di Aviano (PN). Lo scopo di tale studio è stato quello di modulare il dosaggio dell’irinotecano (CPT-11) in presenza dell’inibitore angiogenetico bevacizumab (BV), non essendo ancora nota l’interazione tra i due farmaci, in base al genotipo di UGT1A1, al fine di ottenere un miglioramento dell’indice terapeutico per ogni singolo paziente. Per fare ciò, si è ritenuto necessario sviluppare un metodo di analisi di farmacocinetica specifico e si è pensato di procedere nel seguente modo: * Sviluppo di un metodo quantitativo per l’analisi del farmaco d’interesse * Validazione del metodo in accordo con le linee guida dell’FDA * Misurazione delle concentrazioni plasmatiche del farmaco * Determinazione della farmacocinetica del farmaco * Correlazione dei dati di farmacocinetica e farmacogenetica Sono stati arruolati pazienti con diagnosi istologica di adenocarcinoma colorettale (CRC) metastatico, non pretrattati con chemioterapia o trattati con terapia adiuvante (escluso irinotecano), e rispondenti ai criteri di eleggibilità/esclusione previsti dal protocollo. I pazienti sono stati assegnati al loro gruppo di trattamento in base al genotipo (*1/*1 o *1/*28) fino al completamento del reclutamento per ogni livello di dose in ogni gruppo di pazienti. I pazienti con genotipo *28/*28 sono stati esclusi perché ad alto rischio di tossicità. La dose iniziale di irinotecano somministrata nei pazienti portatori dell’allele *1 (wild type ed eterozigoti) è di 260 mg/m2. La dose di BV è di 5 mg/kg, somministrata anch’essa in infusione ogni due settimane. Il dosaggio dell’irinotecano è stato incrementato a 310 e 370 mg/m2 qualora nel gruppo di trattamento con dosaggio più basso non vi sia stata tossicità. La valutazione delle interazioni farmacocinetiche e farmacodinamiche tra bevacizumab (BV) ed irinotecano (CPT-11) è stata condotta descrivendo il profilo farmacocinetico del CPT-11 (e dei suoi metaboliti) in assenza ed in presenza di BV nello stesso paziente. Da una prima analisi dei parametri farmacocinetici sembra che si possa escludere un effetto del BV sulla farmacocinetica dell’irinotecano. La sovrapponibilità del dato farmacocinetico con o senza BV, è valida per entrambi i dosaggi di irinotecano considerati. Tuttavia, sono stati riscontrati dei valori di Dose Massima Tollerata (MTD) inferiori rispetto a quelli determinati da lavori precedenti, e ciò potrebbe suggerire che l’aggiunta del BV comporti una variazione nella manifestazione di tossicità in regimi ad alto dosaggio. Una percentuale non trascurabile di pazienti ha ottenuto una riduzione del numero e delle dimensioni delle lesioni secondarie epatiche tanto da renderle aggredibili chirurgicamente o tramite termoablazione, facendo pertanto concludere che il regime terapeutico si configuri quindi come una conversion therapy. Poiché i farmaci che sono stati studiati in questo protocollo sono presenti nella pratica clinica da diversi anni, la notevole variabilità riscontrata nella risposta e nello sviluppo di tossicità rende indispensabile trovare dei criteri utili alla personalizzazione del trattamento. Criteri fondamentali per la personalizzazione della terapia sono i parametri clinici, principalmente il genere e l’età dei pazienti. Molti dei soggetti anziani, infatti, ricevono dei trattamenti ridotti poiché tollerano meno le terapie dei protocolli clinici standard, con una notevole riduzione del dosaggio di farmaco o del numero di cicli di trattamento. Proprio per le loro caratteristiche fisiologiche, i pazienti oncologici anziani riportano maggiori effetti di tossicità associati al trattamento rispetto ai soggetti definiti giovani. Analogamente, anche le donne sono spesso escluse da alcuni protocolli soprattutto per la variabilità ormonale che caratterizza l’età fertile e il periodo della menopausa. A tale proposito, in una seconda parte del progetto di dottorato, abbiamo considerato una casistica molto ampia di pazienti affetti da CRC trattati con fluoropirimidine associate ad altri farmaci (FOLFIRI o FOLFOX) presso il Centro di Riferimento Oncologico di Aviano (PN) e altri centri aderenti al programma. Lo scopo è stato quello di individuare dei possibili determinanti farmacogenetici (PG) che condizionano gli effetti del farmaco (tossicità e risposta) in maniera differente tra soggetti giovani e anziani, e tra i due generi (maschio e femmina), nonché dei possibili marcatori di rischio tumorale specifici. Sono stati analizzati diversi polimorfismi di geni codificanti per proteine coinvolte nei meccanismi di attivazione, metabolizzazione ed eliminazione dei farmaci principalmente usati nelle terapie contro il CRC e altri polimorfismi di geni che regolano il ciclo cellulare in quanto coinvolti nel processo di carcinogenesi e di progressione tumorale. Molte delle variazioni alleliche analizzate confermano un’associazione con il rischio d’insorgenza del tumore, altre con la sopravvivenza dei pazienti. In particolare, la variazione del copy number dei geni codificanti per l’enzima Glutatione S-trasferasi, GSTT1 e GSTM1, ha messo in evidenza una correlazione con l’età di diagnosi dei pazienti, nonché con il genere. L’aumento delle copie di GSTM1 o la riduzione del GSTT1 sono associati a una maggiore sopravvivenza nei soggetti con età superiore a 70 anni e di sesso maschile (PGSTM1=0.047, HR=3.937, 95% CI=0.31–0.89; PGSTT1=0.039, HR=4.246). Abbiamo ulteriormente riscontrato una specifica associazione del genotipo GSTnull con un aumentato rischio d’insorgenza tumorale nei soggetti giovani, ma non nei soggetti anziani. Si può quindi ipotizzare che vi sia una riduzione dell’attività enzimatica della Glutatione-S Transferasi con conseguente deficit ai meccanismi di detossificazione cellulare che comportano un incremento dei danni a carico del DNA. Gli ulteriori dati ottenuti, ci permettono di concludere che ci possono essere delle differenze associate alle caratteristiche genotipiche relative sia al genere che all’età dei pazienti: ci sono polimorfismi predittivi di rischio prevalentemente associati ad uno dei due generi (MTHFR 1298A>C nelle giovani donne); altri polimorfismi localizzati nei geni del riparo del DNA sono prevalentemente associati ad un rischio maggiore e ad una sopravvivenza minore nella popolazione anziana. È pertanto fondamentale che, grazie alle nuove conoscenze nell’ambito della medicina molecolare e alle nuove tecnologie, si arrivi alla personalizzazione della terapia, al fine di massimizzare la risposta e ridurre gli effetti tossici in ciascun paziente.