T-CELL LARGE GRANULAR LYMPHOCYTE LEUKEMIA: PATHOGENESIS AND MOLECULAR DEVELOPMENT

Large granular lymphocyte leukemia (LGLL) is a rare and heterogeneous lymphoproliferative disorder characterized by the chronic proliferation of clonal large granular lymphocytes (LGLs) with cytotoxic activity. Two subtypes of LGL proliferations are distinguished: the most common type (~85% of cases), T-LGL Leukemia (T-LGLL), is sustained by T-cells and the rarer type (~15% of cases), Chronic Lymphoproliferative Disorder of Natural Killer cells (CLPD-NK), sustained by NK-cells. This PhD will focus on the T-LGL Leukemia. The etiology of T-LGLL still remains matter of debate. The main hypothesis suggests an antigenic stimulation as initial step activating LGLs, which undergo a clonal expansion then maintained by the abnormal release of cytokines (mainly IL-6 and IL-15) and by an impairment of the apoptotic machinery due to the activation of several survival pathways. The project developed in this PhD was aimed to better define this etiopathogenetic hypothesis and to find new therapeutic targets. First of all, we have taken into account the JAK/STAT pathway, reported to be deregulated in T-LGLL. We focused on STAT3, constitutively activated in LGLs, and its specific inhibitor SOCS3, that we found to be down-expressed and unresponsive to IL-6 triggering. The pathophysiology of this mechanism is unclear, since we found no methylation in SOCS3 promoter region; anyway we still hypothesize an epigenetic mechanism, since the use of a demethylating agent restored SOCS3 responsiveness. We then focused our attention on the main activator of STAT3/SOCS3 axis, IL-6, and we observed that it enhances LGL survival through STAT3 phosphorylation. We also provided evidence that IL-6 is mainly expressed by LGLs-depleted PBMC population of T-LGLL patients characterized by low levels of circulating LGLs (<55%). The involvement of IL-6 in leukemic LGL survival was confirmed by the observation that incubation with anti-IL-6 and anti-IL-6Rα (IL-6 receptor) induced apoptosis in LGLs, likely related to a reduction of STAT3 phosphorylation. The next step was the analysis of IL-6 receptor system that is composed of two functionally different chains: IL-6Rα and gpl30. Our data suggested that IL-6 acts through a trans-signaling mechanism in T-LGLL, being IL-6Rα highly detected in patients’ plasma and poorly expressed by LGLs. Interestingly, trans-signaling is peculiarly implicated in inflammatory disease. Among STAT3 target genes, CCL5 is a chemotactic agent reported to be over-expressed in LGL leukemia. In our lab we found that its expression is responsive to IL-6 stimulus. Since the BM of patients is frequently infiltrated by LGLs and mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are reported to be a putative source of IL-6, we studied their role in T-LGLL and demonstrated that they promote LGL survival and may trigger CCL5 expression in LGLs, through IL-6 release. We then focused on IL-15, a T-LGLL key cytokine mainly expressed by T-LGLL patients’ dendritic cells (DC), these latter being considered the responsible for LGL activation through antigen presentation. We studied IL-15 effects on IL-6 signaling and we found that this cytokine promotes the trans-signaling mechanism through an enhanced IL-6 expression by patients’ PBMCs and the inhibition of IL-6Rα expression by LGLs. Finally, recent data in the literature reported mutational hot spots in SH2 domain of STAT3, suggesting that STAT3 constitutive activation may result from these acquired genetic mutations. Accordingly, we analyzed whether patients’ LGLs showed any of STAT3 hot spot mutations up to now quoted. We observed that two mutations, D661Y and Y640F, were detected in nearly 20% of cases and more specifically in patients characterized by a high percentage of circulating LGLs (>55% ), accounting for 40% of all LGL cohort.

La malattia linfoproliferativa dei linfociti granulati (LGLL) è una malattia rara caratterizzata da una linfocitosi cronica dei grandi linfociti granulati (LGL) con attività citotossica. Da un punto di vista immunologico, si distinguono due forme di LGLL: La T-LGLL, caratterizzata dalla proliferazione di LGL di tipo T, nonché forma più frequente della patologia (~85% dei casi) e la NK-CLPD, più rara (~15% dei casi) in cui la linfocitosi viene sostenuta da cellule di tipo NK. L’eziopatogenesi della T-LGLL risulta essere ancora materia di dibattito. L’ipotesi più accreditata indica la stimolazione antigenica come evento in grado di attivare gli LGL; queste cellule intraprendono dunque un’espansione clonale, che viene mantenuta in un secondo tempo dal consistente rilascio di citochine (prevalentemente IL-6 ed IL-15) e da un equilibrio vita/morte cellulare alterato, generato quest’ultimo dalla contemporanea attivazione di numerose vie di sopravvivenza cellulare. Nel nostro laboratorio abbiamo seguito differenti linee di ricerca, con l’obiettivo di verificare tale ipotesi eziopatogenica e trovare nuovi target terapeutici. Abbiamo preso prima di tutto in considerazione la via di segnale JAK/STAT, che si riporta essere alterata nella T-LGLL. Ci siamo soffermati in particolare sulla proteina STAT3, che risulta essere costitutivamente attivata, e su SOCS3, suo specifico inibitore, emerso essere, dai nostri studi, down-espresso e non responsivo all’IL-6 nella T-LGLL. Le basi fisiologiche determinanti il mancato meccanismo a feed-back negativo di SOCS3 non risultano ancora definite, dal momento che il promotore di SOCS3 non è risultato essere regolato tramite metilazione; è possibile tuttavia che un meccanismo epigenetico sia comunque responsabile dell’alterata regolazione della via di segnale JAK/STAT, in quanto abbiamo osservato che l’uso di un agente demetilante è in grado di ripristinare l’attività inibitoria di SOCS3. Abbiamo quindi analizzato il principale attivatore dell’asse STAT3/SOCS3, ovvero l’interleuchina 6 (IL-6), evidenziando come tramite l’attivazione di STAT3 essa sia in grado di promuovere la sopravvivenza degli LGL. Abbiamo inoltre rilevato che tale citochina è espressa in particolar modo dai PBMC non LGL di pazienti caratterizzati da bassi livelli di LGL circolanti (<55%). Il coinvolgimento di IL-6 nella sopravvivenza degli LGL è stato confermato da un’induzione dell’apoptosi in seguito a coltura con anticorpi bloccanti anti-IL-6 ed anti-IL-6Rα (recettore α dell’IL-6), dovuta ad una riduzione dei livelli di STAT3 attivata. Passaggio successivo è stato analizzare il sistema recettoriale di IL-6, composto da due differenti catene: IL-6Rα e gpl30. I dati ottenuti suggeriscono un meccanismo di trans-signaling, particolarmente coinvolto nei processi di tipo infiammatorio, alla base dell’azione di IL-6 nella T-LGLL; IL-6Rα è presente infatti ad alti livelli nel plasma dei pazienti, pur venendo scarsamente espresso dagli LGL. Tra i geni target di STAT3 vi è CLL5, un potente agente chemotattico che si riporta essere over-espresso nella T-LGLL; nel nostro laboratorio abbiamo osservato inoltre che la sua espressione è responsiva allo stimolo con IL-6. Dal momento che il midollo osseo dei pazienti risulta essere frequentemente infiltrato dagli LGL e che le cellule mesenchimali stromali (BM-MSCs) risultano essere una presunta fonte di IL-6, abbiamo analizzato il ruolo di queste cellule nella T-LGLL e dimostrato che esse sono in grado di promuovere la sopravvivenza degli LGL e probabilmente stimolare l’espressione di CCL5 da parte degli LGL, tramite il rilascio di IL-6. Abbiamo studiato l’interleuchina 15 (IL-15), una citochina chiave della T-LGLL espressa in particolar modo dalle cellule dendritiche (DC) dei pazienti, considerate responsabili dell’attivazione degli LGL tramite presentazione dell’antigene. Abbiamo analizzato gli effetti di IL-15 sul signaling di IL-6 ed abbiamo evidenziato come tale citochina sia in grado di promuovere il meccanismo di trans-signaling attraverso l’induzione d’espressione di IL-6 nei PBMC dei pazienti e l’inibizione dell’espressione di IL-6Rα negli LGL. Dati recenti di letteratura riportano, infine, hot spot mutazionali nel dominio SH2 di STAT3; è stato ipotizzato che la costitutiva attivazione di STAT3 sia dovuta a tali mutazioni, per tale motivo abbiamo indagato, nella nostra coorte di pazienti, la presenza delle mutazioni descritte finora riportate in letteratura. Abbiamo riscontrato le due mutazioni, D661Y e Y640F, sono presenti in circa 20% dei casi e specificamente in pazienti caratterizzati da un’alta percentuale di LGL circolanti (>55%), che costituiscono il 40% dei casi con LGLL.