Identification and characterisation of novel genes in motor neuron disorders

Hereditary Motor Sensory Neuropathy (HMSN), also known as Charcot-Marie-Tooth disease (MIM118300), is an heterogeneous group of Mendelian diseases which affects the peripheral motor and sensory nervous system (PNS). With a prevalence of about 1/2500 individuals, it is considered the most common inherited neuromuscular disorder. The clinical hallmarks include slow and progressive muscular weakness of distal limbs, peroneal atrophy and bilateral pes cavus, however they are often associated with other signs such as spastic paraplegia, ataxia, mental retardation and incontinence. Distal HMN disorders are a subgroup of HMSN characterized by a predominant motor involvement and minor or no sensory loss. To date, more than 50 genes have been detected for HMSN and 17 genes for dHMN, but many disease-genes have to be identified yet. This study aims to identify and, whenever possible, functionally characterise novel genes causing different forms of peripheral neuropathy. In order to achieve this objective, four families affected by complex HMSN or distal HMN and showing no mutations in known disease-genes were examined. The identification of novel genes was performed by using a strategy which integrates the traditional positional cloning approach with the next-generation whole-exome sequencing. In all the four families candidate linkage regions were identified by genome-wide linkage analysis, specifically for the recessive forms they were identified also by homozygosity mapping and identity-by-descent analysis using high-density SNPs arrays and STR markers. In one family a candidate-genes screening by Sanger sequencing was preferred for the small size of the critical region. In the remaining three families the whole-exome sequencing (WES) approach was adopted in order to inspect all coding variants within the previously identified linkage regions. Considering the advantage of having variants within the whole exome, known disease-related genes were also analysed and less stringent genome wide searches were even conducted. Moreover, coverage analysis was performed and poorly-covered exons were sequenced. The best candidate variants were selected by filtering and prioritization analyses which allowed to evaluate the putative pathogenicity of variants. For the variants which represented potential mutations, further confirmations were obtained by in silico analyses, control population screening, unrelated patients characterization and functional studies. This work represents the first step to demonstrate the pathogenicity of a candidate variant and dissect the mechanisms underlying peripheral neuropathies.

La neuropatia ereditaria sensitivo-motoria (HMSN), anche denominata malattia di Charcot-Marie-Tooth (MIM118300), costituisce un gruppo eterogeneo di disordini mendeliani che colpiscono il sistema nervoso periferico motorio e sensitivo. Tale malattia è considerata il disordine neuromuscolare ereditario più comune, con una prevalenza stimata di 1 caso su 2500 nella popolazione. I segni clinici distintivi includono una progressiva ipostenia e ipotrofia dei muscoli distali degli arti, un’atrofia peroneale e piede cavo bilaterale. Questo fenotipo clinico è di frequente associato ad altri sintomi, quali la paraparesi spastica, il ritardo mentale, atassia e disturbi urinari. Le neuropatie ereditarie motorie distali (dHMN) costituiscono un sottogruppo delle neuropatie ereditarie sensitive-motorie, caratterizzato da un prevalente coinvolgimento motorio e un minore o assente interessamento sensitivo. Ad oggi, più di 50 geni sono stati associati alle neuropatie ereditarie sensitivo-motorie e 17 alle forme motorie distali, tuttavia molti geni rimangono ancora sconosciuti. Il presente studio si prefigge di identificare e possibilmente caratterizzare dal punto di vista funzionale, nuovi geni causativi di varianti ereditarie di neuropatia periferica. A tale scopo sono state studiate quattro famiglie in cui erano presenti soggetti affetti da HMSN complesse o dHMN e nelle quali erano state escluse le mutazioni nei geni malattia già noti. Al fine di identificare nuovi geni causativi, in questo lavoro è stata adottata una strategia che va ad integrare l’approccio tradizionale di clonaggio posizionale con il sequenziamento next-generation dell’esoma. Nelle quattro famiglie oggetto di studio, mediante SNPs ad alta densità e marcatori microsatelliti, è stata svolta una analisi di linkage genome-wide e si sono identificate regioni candidate; inoltre per le forme recessive si è proceduto con il mappaggio per omozigosità e l’analisi di identità per discendenza (IBD). In una di queste famiglie, data la ridotta estensione della regione candidata, lo screening mutazionale dei geni candidati è avvenuto per mezzo del sequenziamento diretto. Nelle rimanenti tre famiglie, invece, è stato adottato l’approccio di sequenziamento next-generation dell’esoma, al fine di analizzare tutte le varianti presenti negli esoni codificanti delle regioni in linkage. Il vantaggio di avere un’informazione estesa all’intero esoma ha permesso un’analisi genome-wide meno stringente e la ricerca delle varianti nei geni malattia già noti. L’analisi dell’efficienza di copertura delle regioni candidate ha permesso invece di sequenziare gli esoni poco coperti di queste regioni. Un’approfondita e dettagliata analisi di filtraggio e prioritizzazione ha reso possibile valutare la possibile patogenicità delle varianti e di identificare le migliori candidate. A partire da queste, ulteriori validazioni sono state poi ottenute mediante studi in silico, screening di popolazione di controllo, caratterizzazione di pazienti non imparentati e studi funzionali. Tale studio costituisce il primo step fondamentale per identificare nuovi geni causativi e studiare nel dettaglio i meccanismi alla base delle neuropatie distali. A tale scopo screening genetici su coorti di pazienti e studi funzionali potranno far luce sull’effettivo coinvolgimento di questi nuovi geni candidati nelle neuropatie periferiche.