LAB on CHIP: capacitive stimulation of cells

The main target of the LAB on CHIP phD project, funded by Fondazione Cariparo, was to develop a device to allow the handy production of CHO cell clones in order to built recombinant proteins for therapeutic targets. In particular, a major aim is to reduce time and costs associated with clones manufacturing. Cultivated mammalian cells have become the dominant system for the production of recombinant proteins for clinical applications, because of their capacity for proper protein folding, assembly and post-translational modification. The quality and efficacy of a protein can be superior when expressed in mammalian cells versus other hosts such as bacteria, plants and yeast. Today more than 60 % of all recombinant protein pharmaceuticals are produced in mammalian cells. Expression vectors for recombinant cell line generation generally use a strong viral or cellular promoter/enhancer to drive the expression of the recombinant gene. But non-viral gene transfer remains the preferred approach to generate stable cell lines for manufacturing purposes: calcium phosphate transfection, electroporation, lipofection. Transfection is a complex process, and in order to be successful all steps involved must work efficiently. The device developed is based on the physical phenomenon called electroporation, that is the formation of temporary pores in the plasmatic membrane upon application of electric fields. As the biological world is intrinsically variable, common approaches for improving electrotransfection rely on time consuming empirical attempts. It is therefore important to develop new methods enabling a fine control of all critical parameters involved to identify causes of failure and to improve efficiency. On-chip electroporation through capacitive currents can be such a method. To directly assess the formation of pores in the cell membrane, we performed patch-clamp experiments during on-chip electroporation. Thus, most promising protocols were selected and assessed for their electrotransfection efficiency. Moreover, patch clamp experiments allowed to study the dynamics of pores formation and resealing. Regarding the develop of the device, the biocompatibility of titanium dioxide, selected as dielectric material, was tested. The inertness against cellular environment and the state of cell culture were considered. Cell cultures showed healthy state and normal development, good adhesion and normal replication time. No chemical reactions that can damage the culture were observed. The chemical inertness was considered in the reverse direction too. Metabolic products of cell culture did not lead to chemical corrosion of the dielectric surface. So, the patch-clamp on-chip electroporation recordings allowed to select the promising protocol that was tested on CHO cultures. The prototype proposed demonstrated electrotransfection through capacitive coupling between cell and chip. The electroporation efficiency obtained is around 30%. Moreover, the selectivity of the device was demonstrated, and its applicability both in electrotransfection and electroporation for staining application. Collateral results were obtained concerning the formation of pore on attached and free membrane and the possibility of study pore dynamics

Scopo principale del progetto di Dottorato "LAB on CHIP" finanziato dalla Fondazione Cariparo è stato lo sviluppo di un dispositivo che agevoli la creazione di cloni di cellule CHO per la produzione di proteine a scopo terapeutico. In particolare il fine ultimo è quello di ridurne tempi e costi associati alla produzione. Le cellule di mammifero in coltura sono ormai il sistema più diffuso per la produzione di proteine per applicazioni cliniche. La qualità e l'efficacia di una proteina possono essere superiore se essa è espressa in cellule di mammifero rispetto ad altri organismi, quali batteri, piante e lieviti. Ad oggi più del 60 % di tutte le proteine ricombinanti per applicazioni farmaceutiche è prodotto in cellule di mammifero. Vettori di espressione per la creazione di linee cellulari stabili da DNA ricombinante utilizzano vettori virali per indurre l'espressione del gene. Ma la transfezione senza l'ausilio di virus rimane l' approccio prediletto per la generazione di linee stabili per questi scopi. La transfezione è un processo complesso e, affinchè avvenga con successo, tutti i sottoprocessi coinvolti devono svolgersi efficientemente. Il dispositivo proposto si basa sul fenomeno fisico chiamato elettroporazione, che non è altro che la formazione di pori temporanei nella membrana plasmatica a seguito dell'applicazione di opportuni campi elettrici. I comuni approcci utilizzati per migliorare la transfezione tramite elettroporazione richiedono tempi lunghi e possono essere inefficaci. E' importante poter sviluppare metodi nuovi che permettano un controllo di tutti i parametri critici coinvolti in modo da poterne identificare le cause in caso di fallimento e dunque migliorare l'efficienza. L'elettroporazione su chip utilizzzando correnti capacitive può essere un valido approccio. Per poter rilevare la formazione di pori, sono stati fatti esperimenti di patch-clamp su chip durante l'elettroporazione. In tal modo sono stati selezionati i protocolli più promettenti. Per quanto riguarda lo sviluppo del dispositivo, ne è stata verificata la biocompatibilità. Si è valutato lo stato delle colture cellulari che hanno mostrato normali sviluppo, adesione e tempo di replicazione. Non sono state rilevate reazioni chimiche tra il mezzo di coltura e il diossido di titanio. Non si sono inoltre rilevati problemi di corrosione o danneggiamento dell'ossido a causa di prodotti metabolici della cellula. Gli esperimenti di patch-clamp hanno permesso di selezionare un protocollo che è stato poi testato sulle cellule in coltura. Il prototipo sviluppato ha dimostrato l'elettroporazione di cellule CHO in coltura, ottenendo un'efficienza media del 30 %. E' stata inoltre dimostrata la selettività di tale dispositivo e la sua applicabilità sia per la transfezione che per l'introduzione nella cellula di marcatori. Risultati "collaterali" ottenuti riguardano la dimostrazione della formazione di pori temporanei sia sulla membrana adesa che su quella libera e la possibilità di studiare la dinamica dei pori