Post-translational mechanisms regulating Glutathione Peroxidase 4

Glutathione peroxidase 4 (GPx4) is a selenocysteine-containing homolog of the vertebrate glutathione peroxidase family, peculiarly reducing membrane hydroperoxide by glutathione (GSH). GPx4 was first purified in 1982 as a ‘peroxidation inhibiting protein’, and is emerging to date, together with its substrate GSH, as a major determinant in regulating cell balance between proliferation and death. Recently, it emerged that GPx4 inactivation or GSH depletion in cells causes death by a novel subroutine relying on lipid peroxidation, named ferroptosis. Consistently, reverse genetics studies indicate that all the tissues where GPx4 is in so far silenced undergo degeneration. Understanding therefore GPx4 turnover is a crucial issue. Major aim of this work was therefore clarifying whether GPx4 could be a Nedd4 substrate, and thus proteasomal degradation could have a role in GPx4 turnover. This hypothesis was suggested by the presence of a conserved LPXY motif observed in silico at the C-terminal end of GPx4, a canonic position typical of many substrates of the WW domains-containing E3 ligases of the Nedd4 family. In Nedd4.1/Nedd4.2 and GPx4 co-transfected cells, the Nedd4 isoforms are co-immunoprecipitated by GPx4, while mutation at the conserved C-terminal LPXY motif on GPx4, yields a decreased signal of the Nedd4 band, suggesting that the binding between GPx4 and the two Nedd4 isoforms relies indeed on the LPXY motif. Ubiquitylation is observed in co-transfected cells immunoprecipitated as above, but the ubiquitylation pattern is not affected when an inactive mutant of the catalytic Cys of Nedd4.1 or Nedd4.2 is co-transfected with GPx4. Purified rat GPx4 is not ubiquitylated in an in vitro assay containing home made recombinant Nedd4.1, E1, E2, ATP and ubiquitin (Ub). Furthermore, overexpressed Nedd4.1 fails to accelerate endogenous GPx4 clearance following a ferroptotic signal, such as GSH depletion or GPx4 modification by the ferroptosis-inducing compound 1S,3R RSL3. In the GSH depletion model, however, GPx4 protein and activity decreases in the cytosol, while, surprisingly, it appears in the pellet, containing the membrane fraction, in a non-ubiquitylated form. Dissociation constant measurement by SPR analysis on model liposomes interacting with purified GPx4 indicates a decrease in the absence of GSH, while a combined docking and molecular dynamic approach shows that GPx4 binds to the polar head of membrane phospholipid by its basic zone adjacent to the catalytic site. Furthermore, upon oxidation, GSH releases the enzyme in the cytosol by interacting with some residues of the basic zone involved in phospholipid binding. Thus our work, although showing a LPXY motif-dependent binding between both the Nedd4 isoforms and GPx4, fails to validate the hypothesis that GPx4 is ubiquitylated by these ligases, which appear indeed not involved in GPx4 turnover. Yet, the observation that GPx4 translocates to membrane under GSH depletion opens interesting perspectives in the understanding of the mechanism underlying the action of GPx4 on biological membranes.

La Glutatione Perossidasi 4 (GPx4) è un omologo dei vertebrati delle glutation perossidasi. La selenocisteina nel sito catalitico è l’amminoacido redox-attivo, implicato nella riduzione degli idroperossidi di membrana a spese del glutatione (GSH). La GPx4 fu per la prima volta purificata nel 1982, come ‘proteina inibente la perossidazione’ e ad oggi sta emergendo, insieme al suo substrato GSH, come un elemento determinante nel regolare l’equilibrio tra proliferazione e morte cellulare. Infatti risultati recenti indicano che l’inattivazione della GPx4 o la deplezione di GSH causa morte cellulare attraverso un nuovo meccanismo programmato basato sulla perossidazione lipidica, chiamato ferroptosi. Studi di genetica inversa indicano che tutti i tessuti dove la GPx4 è silenziata, subiscono degenerazione. La comprensione, perciò, dei meccanismi che sottendono il ricambio (turn-over) della GPx4 appaiono cruciali. Il principale obiettivo del lavoro è stato quelle chiarire se la GPx4 potrebbe essere un substrato di Nedd4, e se la degradazione proteosomale potrebbe avere un ruolo nel ricambio del selenoenzima. Questa ipotesi è stata suggerita dalla presenza di un motivo strettamente conservato LPXY, osservato in silico all’estremità C-terminale della GPx4. Questo motivo infatti è noto per essere riconosciuto dai domini WW contenuto nelle E3-ligasi della famiglia delle Nedd4 ed è presente in molte proteine che sono substrato di Nedd4. Nelle cellule co-trasfettate con Nedd4.1/Nedd4.2 e GPx4, l’isoforma di Nedd4 co-immunoprecipita con la GPx4, mentre la mutazione del motivo C-terminale LPXY della GPx4, provoca un decremento del segnale della banda di Nedd4, suggerendo che il legame tra la GPx4 e le due isoforme di Nedd4 dipenda dal motivo LPXY. Si osserva anche ubiquitinazione nelle cellule co-trasfettate e immunoprecipitate come sopra, ma il ‘pattern’ di ubiquitinazione non è influenzato se un mutante inattivo della cisteina catalitica di Nedd4.1 o Nedd4.2 è co-trasfettato con la GPx4. Inoltre la GPx4 di ratto purificata non è ubiquitinata in un saggio di ubiquitinazione in vitro contenente la Nedd4.1, gli enzimi E1 e E2, ATP e ubiquitina (Ub). Inoltre, la sovra espressione di Nedd4.1 non induce un’accelerazione del ricambio della perossidasi, sia quando le cellule non sono trattate che a seguito di uno stimolo ferroptotico, come la deplezione di GSH o l’alchilazione di GPx4 tramite 1S,3R-RSL3. Nel modello di deplezione del GSH, comunque, la proteina GPx4 e la sua attività subiscono una riduzione nel citoplasma, mentre sorprendentemente, la proteina appare nel ‘pellet’, che contiene la frazione delle membrane in forma non ubiquitinata. La costante di dissociazione dell’interazione di GPx4 e di liposomi contenenti tetraoleilcardiolipina (TOCL), misurato con la tecnica Surface Plasmon Resonance (SPR) diminuisce in assenza di GSH. Inoltre un approccio combinato di docking e dinamica molecolare indica che la GPx4 si lega alle teste polari dei fosfolipidi di membrana attraverso un’ area basica adiacente al sito catalitico. Inoltre, dopo ossidazione della GPx4, il GSH rilascia la perossidasi nel citoplasma mediante interazione con alcuni residui della area basica coinvolta nel legame con i fosfolipidi. In conclusione il nostro lavoro dimostra un legame tra entrambe le isoforme di Nedd4 e la GPx4 che dipende dal motivo LPXY, ma non valida l’ipotesi iniziale che la GPx4 possa essere ubiquitinata da queste ligasi, che quindi non sembrerebbero essere coinvolte nel ricambio della proteina GPx4. Tuttavia, l’osservazione che la GPx4 trasloca nelle membrane in condizioni di deplezione di GSH apre interessanti prospettive nella comprensione dei meccanismi che sottendono l’interazione della GPx4 con le membrane biologiche.