Development of nanocarriers with responsive interfacial properties for site-specific drug delivery

The functional and morphological alterations of the vascular endothelium of the lymphatic system, the micro-environmental alterations such as the amplification of the enzyme kit, the overexpression of specific receptors, the increase in the redox potential, temperature and the lowering of the pH, are typical characteristics of tumor tissues. These features can be exploited successfully for the development of suitable supramolecular and colloidal systems with passivelly and activelly guided delivery of anticancer drugs at the site of action. Here we aimed at investigating a novel pH responsive liposomal platform to achive selective tumor targeting to ensure the accumulation of the drug in adequate therapeutic concentration. Liposomes were decorated with a novel non-peptidic cell penetrating enhancer (CPE) that simulates the action of the natural peptides known from the literature studies. A synthetic procedure was developed to obtain a oligoarginyl-dendron derivative to be included in the lipid bilayer of the liposomes. The derivative TetraBoc-Arg(pbf)-[G-2]-distearoyl glycerol (Arg4-DAG) consists of a central polyester core to which arginines were conjugated on one side and that was terminated with a distearoyl glycerol chain on the other. The resulting macromolecule possesses a amphiphilic character in virtue of its two combined moieties: 1) the hydrophobic distearoyl tail acting as lipidic anchor for lipid bilayer association , 2) the positively charged peripheral arginines, which provides for high cationic density and mimic the basic aminoacid residues of TAT peptide, thus conferring the biological activity to the system. The intermediates and the final product were characterized by 1H, 13C NMR and mass spectrometries. Liposomes obtained with a 2:1 HSPC/cholesterol molar ratio were generated with increasing ratio of the CPE with respect to lipids using the post insertion technique which provided for the increase of liposome zeta potential from +8 mV to +24 mV as the ratio of CPE increased from 1% to 4%, then reaching a plateau. The biological properties of fluorescently labelled CPE coated liposomes were investigated on HeLa cancer cells. Flow cytometry analysis and confocal microscopy study confirmed the high capacity of the liposomes to associate with cells. A 30 times higher efficiency of cancer cell association was found with respect to naked liposomes. The CPE coated liposomes demonstrated a remarkable ability to deliver in the cytosol albumin and calcein. BSA was chosen as protein model, whereas calcein was selected because it is a strongly hydrophilic molecule, so as to mimic the behavior of water soluble drugs. Both molecules were incorporated into the hydrophilic core of liposomes. The calcein was not release from the liposomes for at least 16 days, whereas BSA was completely released in 7 days. In order to confer to liposomes sensitivity to pH alterations for controlled access to cancer cells, a pH sensitive polymer of mPEG-oligosulphadimethoxine (mPEG5kDa-SDM8) was synthesized by radical polymerization of sulfadimethoxine methacrylate from 2-bromo-isobutyryl-methoxyPEG (mPEG-Br) 5kDa. mPEG5kDa-SDM8 possesses a pKa of 7.12 which ensures a deprotonated state with negative charge at physiological pH (7.4) and a protonated neutral state at pH 6.5, which corresponds to the tumor environment. Zeta potential analysis performed on Arg4-DAG coated liposomes decorated with the mPEG5kDa-SDM8 polymer confirmed that the most finely regulated shielding/unshielding capacity is obtained when the two modules are equimolar, both at 4% in moles with respect to lipids. This formulation was found to be stable even in the presence of serum proteins, which does not alter the charge-to-charge interaction between the oligo-sulfadimethoxine of the pH responsive polymer and oligo-arginines of the CPE as observed by zeta potential analysis. The SPR study also confirmed this result, proving the polymer association with the CPE coated liposomes at pH 7.4 and the release at pH 6.5 mimicking the tumor, which corresponds to a sheddable physical PEGylating under controllable conditions. Finally, the biological studies confirmed the ability of the pH responsive polymer to shield the CPE on the liposomal surface under physiological conditions (pH 7.4), which prevents the internalization of both the unloaded pH responsive vesicles, and the calcein loaded vesicles, whereas revealing it when exposed to tumor mimicking acid environment, allowing for liposome cell entry and payload intracellular delivery.

Alterazioni funzionali e morfologiche dell'endotelio vascolare del sistema linfatico, alterazioni micro-ambientali quali l'amplificazione del kit enzimatico, sovraespressione di recettori specifici, aumento del potenziale redox, temperatura e abbassamento del pH, sono caratteristiche tipiche dei tessuti tumorali. Queste caratteristiche possono essere sfruttate con successo per lo sviluppo di sistemi colloidali sopramolecolari in grado di direzionare passivamente o attivamente farmaci antitumorali al sito d'azione. In questo lavoro è stata indagata una nuova piattaforma liposomiale sensibile al pH per il direzionamento selettivo al tumore e assicurare l'accumulo del farmaco in concentrazione terapeutica adeguata. I liposomi sono stati decorati con un nuovo promotore di internalizzazione cellulare non-peptidico che simula l'azione dei peptidi naturali conosciuti dagli studi di letteratura. È stata messa a punto una nuova procedura di sintesi per ottenere il derivato dendronico oligoargininico da includere nel doppio strato lipidico dei liposomi. Il derivato TetraBoc-Arg (PBF) - [G-2] -distearoil glicerolo (Arg4-DAG) è costituito da un nucleo centrale di poliestere a cui le arginine sono state coniugate su un lato e che è stato terminato con una catena distearoil glicerolo dall'altro. La macromolecola risultante possiede un carattere anfifilico in virtù delle sue due frazioni combinate: 1) la coda idrofoba distearoil, elemento lipidico di ancoraggio per associazione al doppio strato lipidico, 2) la carica positiva conferita dalle arginine periferiche, che mimano i residui amminoacidici fondamentali del peptide TAT, conferendo così l'attività biologica del sistema. Gli intermedi e il prodotto finale sono stati caratterizzati da 1H, 13C NMR e spettrometria di massa. I liposomi ottenuti con un rapporto molare 2:1 HSPC/colesterolo sono stati generati con crescente rapporto del CPE rispetto ai lipidi, utilizzando la tecnica di ‘post-insertion’, che ha determinato l'aumento del potenziale zeta dei liposomi da +8 mV a +24 mV, all’aumentare del rapporto di CPE dall'1% al 4%, raggiungendo quindi il plateau. Le proprietà biologiche dei liposomi rivestiti con il CPE fluorescente sono state studiate su cellule tumorali HeLa. L’analisi citofluorimetrica e lo studio di microscopia confocale hanno confermato l'elevata capacità dei liposomi di associare con le cellule. Rispetto al liposomi nudi, è stata rilevata una maggiore efficienza di associazione alla cellula tumorale di 30 volte. I liposomi rivestiti col CPE hanno dimostrato una notevole capacità di veicolare albumina e calceina nel citosol. BSA è stata scelta come proteina modello, mentre calceina è stata scelta perché è una molecola fortemente idrofila, in modo da simulare il comportamento di farmaci idrosolubili. Entrambe le molecole sono state incorporate nel nucleo idrofilo di liposomi. La calceina non è stata rilasciata dai liposomi per almeno 16 giorni, mentre BSA è stata completamente rilasciata in 7 giorni. Al fine di conferire ai liposomi responsività ad alterazioni di pH per l'accesso controllato alle cellule tumorali, è stato sintetizzato un polimero sensibile, pH mPEG-oligosulphadimethoxine (mPEG5kDa-SDM8), mediante polimerizzazione radicalica di sulfadimetossina metacrilato su una catena di 2-bromo-isobutirril-methoxyPEG (MPEG-Br ) 5kDa. mPEG5kDa-SDM8 possiede un pKa di 7,12 che garantisce uno stato deprotonato con carica negativa a pH fisiologico (7.4) e uno stato neutro protonato a pH 6,5, che corrisponde all'ambiente tumorale. L’analisi di potenziale Zeta eseguita su liposomi decorati con Arg4-DAG e con il polimero mPEG5kDa-SDM8 ha confermato che la capacità di schermatura/deschermatura più finemente regolata si ottiene quando i due moduli sono equimolari, entrambi a 4% in moli rispetto al lipidi. Questa formulazione è risultata stabile anche in presenza di proteine ​​del siero, che non alterano l'interazione carica-carica tra l'oligo-sulfadimetossina del pH del polimero reattivo e oligo-arginine del CPE come osservato mediante analisi potenziale zeta. Anche lo studio SPR ha confermato questo risultato, dimostrando l'associazione del polimero con i liposomi rivestiti col CPE a pH 7.4 e il rilascio a pH 6,5, che corrisponde ad una peghilazione fisica reversibile in condizioni controllabili. Infine, gli studi biologici hanno confermato la capacità del polimero pH sensibile di schermare il CPE sulla superficie liposomiale in condizioni fisiologiche (pH 7,4), che impedisce l'internalizzazione delle vescicole non responsive al pH sia non caricate, sia caricate con calceina, mentre il polimero espone il CPE sulla superficie dei liposomi in presenza di un ambiente acido che simula il tumore, consentendo l'ingresso ai liposomi nelle cellule e la veicolazione del loro contenuto a livello intracellulare.