Extracellular collagen type VI has prosurvival and autophagy instructive properties in mouse embryonic fibroblasts

Collagen VI is a major protein of the extracellular matrix with a broad distribution in many tissues, including skeletal muscle and connective tissues. It is composed of three distinct alpha chains, α1, α2 and α3(VI), ecoded by separate genes. Mutations of collagen VI genes in humans cause several muscle diseases, such as Bethlem myopathy and Ullrich congenital muscular dystrophy. Collagen VI null (Col6a1–/–) mice display a myopathic phenotype characterized by mitochondrial dysfunction, spontaneous apoptosis and autophagic impairments in myofibers. These findings indicate that collagen VI has a key role for skeletal muscle homeostasis. Before starting my PhD, I participated to a project aimed at investigating the effects of physical exercise on wild type and Col6a1–/– skeletal muscle. This work demonstrated for the first time that exercise is able to activate the autophagic response in muscle. Moreover, this study revealed that physical exercise it is detrimental for Col6a1–/– muscles. I decided to focus my main PhD work on investigating the role of collagen VI in fibroblasts, which are the major cell type responsible for the secretion and extracellular deposition of this protein, and elucidating the consequences on fibroblasts due to ablation of collagen VI. In patients affected by Bethlem myopathy and Ullrich congenital muscular dystrophy, the mutated forms of collagen VI are produced and retained by fibroblasts, suggesting a potential contribution for this cell type in the onset and progression of muscle defects. To assess how lack of collagen VI impacts on fibroblast functions, I generated stable mouse embryonic fibroblast (MEF) lines from wild type and Col6a1–/– mice and showed that collagen VI is necessary for autophagy regulation and has prosurvival properties in fibroblasts. Col6a1–/– MEFs displayed accumulation of LC3 both basally and following autophagy induction. To dissect the autophagic response of these cells, I studied the autophagy flux and the activity of the nutrient sensor kinase mTOR. I found that in Col6a1–/– MEFs the mTORC1 downstream targets, such as 4E-BP1 and S6, are persistently activated under nutrient depletion stimuli, leading to autophagy inhibition in starving cells. Furthermore, Col6a1–/– MEFs presented a general energy imbalance, leading to over-activation of the AMP-activated protein kinase. These signalling defects lead to massive accumulation of autophagosomes inside Col6a1–/– fibroblasts, due to a compromised autophagosome-lysosome fusion in association with the presence of enlarged lysosomes and LAMP-2 protein depletion. These lysosomal defects are also associated with aberrant localization and activity of TFEB, a master transcription factor for lysosome biogenesis and autophagy regulation. In addition, Col6a1–/– MEFs showed increased susceptibility to cell death, especially under nutrient stress, that ended with activation of the intrinsic pathway of apoptosis. This phenotype was specifically rescued by culturing cells onto purified collagen VI provided as an adhesive substrate . Lack of collagen VI also influenced the organization of the mitochondrial network, which has a key role in cell survival. Mitochondria of Col6a1–/– MEFs exhibited increased fragmented morphology, associated with Parkin translocation and defective mitophagy. These findings show that fibroblasts play a relevant role in the development of the pathophysiological defects of collagen VI null mice, a finding that provide a thus far undisclosed and valuable information for the diagnosis and therapy of inherited diseases associated with collagen VI gene mutations. Moreover, they reveal for the first time a direct effect of collagen VI on the regulation of autophagy and associated mechanisms in this cell type.

Il collagene VI è una proteina della matrice extracellulare con caratteristiche uniche, presente ed abbondante in numerosi tessuti, come in muscolo scheletrico e i tessuti connettivi. Si compone di tre diverse catene, chiamate α1, α2 e α3(VI), codificate da geni distinti. Mutazioni a carico dei geni per il collagene VI nell’uomo sono causa di diverse patologie muscolari, quali la miopatia di Bethlem e la distrofia muscolare congenita di Ullrich. Il modello murino privo di collagene VI (Col6a1–/–), generato nostro laboratorio, sviluppa un fenotipo miopatico caratterizzato da disfunzione mitocondriale, insorgenza di apoptosi e difetti di autofagia nelle miofibre muscolari. Il collagene VI risulta in sostanza fondamentale per l'omeostasi generale del muscolo scheletrico. Al termine della laurea specialistica, ho partecipato ad un primo progetto volto a studiare gli effetti dell'esercizio fisico sul muscolo scheletrico di topi wild-type e Col6a1–/–. Questo lavoro ha dimostrato per la prima volta che l'esercizio fisico è in grado di attivare l'autofagia nel muscolo; in secondo luogo che l'esercizio fisico è dannoso per il muscolo dei topi Col6a1–/–, già soggetti a problemi di attivazione dell'autofagia, escludendone un possibile utilizzo come strategia terapeutica. In seguito ho deciso di focalizzare il mio lavoro di dottorato sullo studio delle alterazioni insorgenti nei fibroblasti privi di collagene VI e sugli effetti diretti di questa proteina sulla regolazione dell'autofagia. Il fibroblasto è il principale tipo cellulare che produce collagene VI. Inoltre, in pazienti distrofici con patologie correlate a mutazioni del collagene VI, le varianti mutate di collagene VI vengono prodotte proprio dai fibroblasti e ritenute all'interno del loro citoplasma, suggerendo così un contributo primario dei fibroblasti nella patogenesi muscolare. Per indagare più a fondo il contributo di queste cellule, ho generato delle linee cellulari di fibroblasti embrionali murini (MEF) da topi wild-type e Col6a1–/– e ho dimostrato come il collagene VI sia necessario per una corretta attivazione di autofagia e per la sopravvivenza dei fibroblasti. Per analizzare la risposta autofagica di queste cellule, ho studiato il flusso autofagico e l'attività della protein chinasi mTOR, uno dei principali sensori cellulari di risposta ai nutrienti. Nei MEF Col6a1–/–, i target a valle di mTORC1, 4E-BP1 ed S6, risultano costantemente attivati anche in seguito a stimoli di induzione di autofagia, ad indicare un'inibizione a valle della via autofagica. Tuttavia, nei MEF Col6a1–/– è presente uno squilibrio energetico generale, che porta all'iper-attivazione della protein chinasi attivata da AMP (AMPK), che a sua volta è implicata nell'induzione di autofagia. Le analisi relative al fattore di trascrizione TFEB, che svolge un ruolo chiave nella biogenesi e funzionalità lisosomiale, dimostrano inoltre un'alterata localizzazione e attività di questo fattore, ad indicare un'alterata risposta trascrizionale del programma autofagico dei fibroblasti Col6a1–/–. Questa complessa situazione porta infine ad un accumulo intracellulare di autofagosomi nei MEF Col6a1–/–, dovuto alla mancata fusione di autofagosomi e lisosomi, ed associato alla presenza di lisosomi dilatati ed alla diminuzione dei livelli proteici di LAMP-2. Inoltre i MEF Col6a1–/– hanno dimostrato una maggiore suscettibilità a morte cellulare indotta da stress o induzione di autofagia, tramite attivazione della via intrinseca di apoptosi. È importante evidenziare che questo difetto viene specificatamente recuperato quando i fibroblasti sono coltivati su collagene VI purificato, fornito come substrato. L’assenza del collagene VI nei MEF Col6a1–/– influenza infine l'organizzazione della rete mitocondriale, la quale è nota svolgere un ruolo chiave nella sopravvivenza cellulare. I mitocondri dei MEF Col6a1–/– risultano infatti più frequentemente frammentati rispetto ai wild-type, e questa alterazione potrebbe facilmente essere correlata con una disfunzione mitocondriale. In questo contesto, i mitocondri Col6a1–/– inducono la traslocazione di Parkin e vengono sottoposti ad un'alterata risposta del processo selettivo di mitofagia. In conclusione, questi risultati dimostrano per la prima volta che i fibroblasti contribuiscono in modo rilevante all’insorgenza e alla progressione dei difetti patofisiologici nei topi Col6a1–/–, fornendo così informazioni preziose e finora ignote per la diagnosi e la terapia delle patologie legate a mutazioni nei geni codificanti per il collagene VI. Inoltre, essi dimostrano che il collagene VI svolge un effetto diretto sulla regolazione dell’autofagia e sui meccanismi ad essa associati in questo tipo cellulare.