Early signaling events involved in muscle remodeling after exercise

Muscle plasticity after exercise is achieved by different molecular mechanisms that regulate gene transcription by impinging on chromatin structure and transcription factors. Exercise is able to induce adaptive response to improve metabolic efficiency, oxidative capacity, and contractile activity by altering gene expression profile and protein levels. Nonetheless, the molecular mechanisms at the basis of these changes remain not very well characterized. The aim of our study is to dissect the early signaling events linked to skeletal muscle remodeling. To address this question we decided to divided the project in two parts. First, we focused our attention on changes in the phosphoproteome after exercise and how this can affect gene transcription. In order to determine the global changes in the phosphoproteome after high intensity exercise we performed a quantitative phosphoproteomic analysis and we compared the stimulated (50 eccentric contraction) to the non-stimulated controlateral muscle. We identified a list of peptides with the strongest increase in phophorylation after eccentric contractions and in particular we found a significant increase in a previously uncharacterized phosphorylation site of myocardin-related transcription factor 2 (MRTF-B), the serine 77. The myocardin/MKL family of proteins has been described as strong coactivators of the Serum Response Factor (SRF), an important signaling pathway known to control skeletal muscle growth. It has been reported in various cell systems that the intracellular localization of MRTF-B is regulated by phosphorylation, enabling it to shuttle from the cytoplasm to the nucleus. We found that after eccentric contractions there is a nuclear accumulation of MRTF-B. Performing a point mutation, in which Serine 77 is replaced by an alanine, the nuclear accumulation of MRTF-B after eccentric contractions is completely abrogated. In order to understand if the nuclear accumulation of MRTF-B after eccentric contractions is also accompanied by an increase in SRF-dependent gene transcription, we performed a microarray analyses 24 hours after stimulation. Performing a gene set enrichment analyses (GSEA) on the differentially regulated genes, we identified SRF activity as one of the major transcription factors whose activity is increased. In the second part of this thesis we analyzed how one bout of exercise can influence histone modification and modify the epigenetic landscape, possibly leading to an increase in SRF-dependent activity. Growing evidence indicates that chromatin remodelling is one of the most important mechanisms that might influence gene expression. Post-translational modifications occurring on histones is emerging as a primary event contributing to the dynamic process of chromatin remodelling. We focused our attention on identifying histone marks, which have been linked to gene transcription, i.e. H3-K4me3, H3-K9K14ac and H3S10ph. We have examined the effect of an acute bout of high-intensity exercise (eccentric contractions) on these histone modifications in mouse skeletal muscle. We have found that histone 3 is very rapidly phosphorylated at serine 10 (H3S10ph) after eccentric contractions, which is completely absent in normal muscles and in the controlateral non-stimulated muscles. Immunofluorescence co-staining for dystrophin showed that this change occurs in about 40% of myonuclei. We have also found that this histone phosphorylation is followed by an increase in the acetylation of the nearby lysine 14, suggestive of an activation of gene transcription. Next we worked on the identification of the putative kinases involved. It has been shown by other groups that the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family is involved in H3S10 phosphorylation. We observed an increase in p38-MSK1 phosphorylation in exercised muscle compared to the control ones. In numerous mammalian cells, the mitogen- and stress-activated protein kinases (MSK1/2) have been identified as the kinases responsible for H3S10ph. Using a siRNA against MSK1 we found that MSK1 is required for H3S10ph after eccentric contractions in skeletal muscle. Indeed we completely abolished nuclear histone 3 staining in fibers electroporated with the siRNA, compared with the surrounding non transfected fibers. We have started to analyse whether histone phosphorylation plays a role in exercise-induced gene expression and to address this we performed chromatin immunoprecipitation (ChIP) and quantitative polymerase chain reaction (real time PCR). Preliminary results show a marked phosphorylation on the promotor of p21, c-fos, Pgc-1α1 and Pgc-1α4 and a consequent expression of these genes. We are currently working on setting up the Chip-seq in order to generate high-resolution maps for the genome-wide distribution of H3S10ph. In addition to our results in mice, we have studied human biopsies taken immediately after high intensity exercise and we have observed similar changes in signaling and histone phosphorylation. In conclusion, we report two early signaling events which occur after high intensity exercise, namely an increase in MRTF-B-SRF dependent gene transcription and histone remodeling linked to gene activation.

La plasticità muscolare dopo l'esercizio è ottenuta tramite diversi meccanismi molecolari che regolano la trascrizione dei geni incidendo sulla struttura della cromatina e sui fattori di trascrizione. L'esercizio fisico è in grado di indurre una risposta adattativa al fine di migliorare l'efficienza metabolica, la capacità ossidativa e l’attività contrattile alterando i profili di espressione genica e i livelli delle proteine. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base di questi cambiamenti non sono ancora ben caratterizzati. Lo scopo del nostro studio è di analizzare i segnali molecolare che stanno alla base del rimodellamento muscolare. Per rispondere a questa domanda abbiamo diviso il progetto in due parti. In primo luogo, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulle variazioni del fosfoproteoma dopo l'esercizio e come questo può influenzare la trascrizione genica. Al fine di determinare i cambiamenti globali del fosfoproteoma dopo esercizio ad alta intensità abbiamo eseguito un'analisi quantitativa fosfoproteomica e abbiamo confrontato i muscoli stimolati (50 contrazioni eccentriche) ai muscoli controlaterali non stimolati. Abbiamo identificato una lista di peptidi in cui c’era un aumento di fosforilazione dopo contrazioni eccentriche e, in particolare, abbiamo individuato un aumento significativo in un sito di fosforilazione precedentemente non caratterizzato nel fattore di trascrizione myocardin-related transcription factor 2 (MRTF-B), la serina 77. Le proteine della famiglia myocardin / MKL sono state descritte come potenti coattivatori del fattore di trascrizione Serum Response Factor (SRF), un importante pathway noto per controllare la crescita del muscolo scheletrico. E' stato riportato in vari sistemi cellulari che la localizzazione intracellulare di MRTF-B è regolata dalla fosforilazione, che determina il suo spostamento dal citoplasma al nucleo. Nel nostro studio abbiamo scoperto che, dopo le contrazioni eccentriche, vi è un accumulo nucleare di MRTF-B. Eseguendo una mutazione puntiforme, in cui la serina 77 è stata sostituita da un’alanina, l'accumulo nucleare del MRTF-B dopo contrazioni eccentriche viene completamente abolito. Per capire se l’accumulo nucleare di MRTF-B dopo contrazioni eccentriche fosse accompagnato da un aumento della trascrizione genica SRF-dipendente, abbiamo effettuato un’analisi microarray 24 ore dopo la stimolazione. Eseguendo un gene set enrichment analyses (GSEA) sui geni differenzialmente regolati, abbiamo identificato SRF come uno dei principali fattori di trascrizione la cui attività è aumentata. Nella seconda parte di questa tesi abbiamo analizzato come una singola ripetizione di esercizio fisico può influenzare le modificazioni degli istoni e modulare il paesaggio epigenetico, in modo da portare a un aumento dell'attività SRF-dipendente. Un numero crescente di osservazioni indica che il rimodellamento della cromatina è uno dei meccanismi più importanti che influenza l'espressione genica. Recentemente sta emergendo come le modificazioni post-traduzionali degli istoni rappresentino un evento primario nel processo dinamico di rimodellamento della cromatina. Abbiamo concentrato la nostra attenzione sull’identificazione di modificazioni post-traduzionali degli istoni collegate ad un aumento della trascrizione genica, ed in particolare: H3-K4me3, H3-K9K14ac e H3S10ph. Abbiamo esaminato l'effetto di una singola ripetizione di esercizio fisico ad alta intensità (contrazioni eccentriche) sulle modificazioni delle code N-terminali degli istoni in muscoli scheletrici murini. Abbiamo osservato un significativo aumento nelle fosforilazione della serina 10 dell’istone H3 (H3S10ph) nei muscoli stimolati, rispetto ai muscoli di controllo in cui questa fosforilazione è completamente assente. Tramite analisi di immunofluorescenza abbiamo dimostrato che questa modificazione post-traduzionale si verifica in circa il 40% dei mionuclei. Abbiamo anche dimostrato che questa fosforilazione dell'istone H3 è seguita da un aumento dell’acetilazione della vicina lisina 14 e che queste modificazioni sono indicative dell’attivazione della trascrizione genica. Successivamente, abbiamo lavorato sull'individuazione delle putative chinasi coinvolte nella fosforilazione dell’istone H3. E’ stato dimostrato, che la famiglia delle MAP-chinasi (MAPK) è coinvolta nella fosforilazione H3S10. Nel nostro studio abbiamo osservato un aumento di fosforilazione di p38-MSK1 nei muscoli soggetti a esercizio rispetto a quelli di controllo. In numerosi tipi cellulari di mammifero, le proteine chinasi MSK1/2 sono state identificate come le chinasi responsabili della fosforilazione sulla serina 10 dell’istone 3. Utilizzando un siRNA contro MSK1 abbiamo scoperto che MSK1 è necessaria per la fosforilazione sulla serina 10 dell’istone 3 dopo contrazioni eccentriche nel muscolo scheletrico. Infatti, le fibre elettroporate con il siRNA non mostrano colorazione nucleare dell’i stone 3 rispetto alle fibre circostanti non transfettate. Infine, abbiamo iniziato ad analizzare il ruolo della fosforilazione dell'istone 3 nella variazione dell’espressione genica indotta da esercizio fisico. Per rispondere a questo interrogativo abbiamo effettuato un’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da PCR quantitativa (real time PCR). I risultati preliminari mostrano una marcata fosforilazione sul promotore di p21, c-fos, PGC-1α1 e PGC-1α4 e la conseguente espressione di questi geni. Attualmente stiamo lavorando sulla configurazione della Chip-Seq al fine di generare mappe ad alta risoluzione della distribuzione in tutto il genoma di H3S10ph. Oltre ai nostri risultati nei topi, abbiamo studiato biopsie umane prelevate subito dopo l'attività fisica ad alta intensità e abbiamo osservato cambiamenti simili nei pathway a monte e nella fosforilazione dell'Istone 3. In conclusione, in questa tesi abbiamo identificato due signaling pathway che si verificano dopo l'esercizio fisico ad alta intensità, vale a dire l’aumento della trascrizione genica dipendente da MRTF-B-SRF e la modificazione post-traduzionale degli istoni legata all’attivazione genica.