Drug discovery in cancer research: hit identification using a fragment-based by NMR approach

Bcl-XL (B-cell-lymphoma-extra large) and the cell surface receptor CD44 are two proteins involved in cancer. Specifically, the anti-apoptotic protein Bcl-XL, a member of the Bcl-2 family, plays a key role in the maintenance of normal cellular homeostasis. However, its overexpression can lead to oncogenic transformation and it is responsible for drug resistance in certain types of cancer. Structurally, the Bcl-2 family is characterized by the presence of BH domains, which are involved in pivotal protein-protein interactions. The anti-apoptotic protein Bcl-XL interacts through its hydrophobic pocket with the BH3 domain of the pro-apoptotic members of the Bcl-2 family, such as Bak and Bax. The inhibition of this interaction eventually promotes cell death. The cell surface receptor CD44, a type I transmembrane glycoprotein, is a hyaluronan-binding protein expressed on the surface of many cell types, where it is involved in leukocyte migration to inflamed sites, T-cell activation, and tumor metastasis. Critical for these processes are the interactions between CD44 and its natural ligand, Hyaluronic Acid (HA). The involvement of CD44 in cell migration and its overexpression on a wide spectrum of tumor cells, make this receptor a good target for drug design of new inhibitors and for delivery of chemotherapeutics to cancer cells. In the first part of thesis, with the aim of identifying an inhibitor of Bcl-XL, we tested a small library of fragments against Bcl-XL using solution Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. Among the compounds tested, one was found to be active with a low millimolar Kd. Starting from this initial hit, we performed structure-activity relationship (SAR) studies of several analogs using both protein-based NMR experiments (mainly 2D [1H,15N]-HSQC) and ligand-based NMR experiments (Saturation Transfer Difference (STD) and waterLOGSY). Our studies led to a hit fragment with a Kd of 811 μM, calculated using the chemical shift perturbations (CSP) from the 2D [1H,15N]-HSQC spectra. Molecular docking studies performed using the experimentally obtained CSP information allowed us to obtain a low energy conformation of the final fragment docked into the hydrophobic binding pocket of Bcl-XL. The second part of this thesis regards CD44, a protein that from structural data is not a particularly druggable target and only a few putative ligand agents are known to bind it in cellular assays. We first attempted to validate these putative ligand agents with biophysical methods, but surprisingly we found that, with the exception of HA and a commercially available antibody, none of these bound recombinant hCD44(21-178) appreciably. In the pursuit of possible novel CD44 antagonists, we performed a fragment screening campaign on 15N-hCD44(21-178) using 1D 1H-aliphatic and 2D [1H,15N]-sofastHMQC NMR experiments. We found two initial structurally related hits and starting from these, further studies were performed using commercially available analogues. These experiments resulted in a fragment hit with a dissociation constant calculated using the chemical shift perturbation from the 2D [1H,15N]-sofastHMQC spectra of 7.43 mM. In conclusion Bcl-XL and CD44 are both overexpressed in many types of cancer cells. Hence, finding ligand agents able to inhibit these two proteins is very a appealing task for the development of new chemotherapeutics. Using a fragment-based by NMR approach, we found two hits for each target, which could be at the basis for further fragment evolution studies for the development of more potent lead compounds.

Bcl-XL (B-cell-lymphoma-extra large) e il recettore transmembrana CD44, sono due proteine coinvolte nel cancro. In particolare, la proteina anti-apoptotica Bcl-XL, membro della famiglia di Bcl-2, gioca un ruolo chiave nel mantenimento della normale omeostasi cellulare. Tuttavia, la sua sovraespressione può portare alla trasformazione oncogenica ed è responsabile per la resistenza ai farmaci in alcuni tipi di cancro. Strutturalmente, questa famiglia è caratterizzata dalla presenza di domini BH, che sono coinvolti in fondamentali interazioni proteina-proteina. La proteina anti-apoptotica Bcl-XL interagisce attraverso la sua tasca idrofobica con il dominio BH3 dei membri pro-apoptotici della famiglia Bcl-2, come BAK e BAX. L'inibizione di questa interazione favorisce infine la morte cellulare. Il recettore di superficie cellulare CD44, è una glicoproteina di transmembrana di tipo I, ed è una proteina che lega l’acido ialuronico espresso sulla superficie di molti tipi di cellule, in cui è coinvolta nella migrazione dei leucociti ai siti di infiammazione, nell'attivazione delle cellule T e nelle metastasi tumorali. Critico per questi processi sono le interazioni tra CD44 e il suo ligando naturale, l’acido ialuronico (HA). Il coinvolgimento di CD44 nella migrazione cellulare e la sua sovraespressione su un ampio spettro di cellule tumorali, rendono questo recettore un buon bersaglio per la progettazione di nuovi farmaci e per il drug delivery di chemioterapici in cellule tumorali. Nella prima parte della tesi, con l'obiettivo di individuare un inibitore di Bcl-XL, abbiamo testato una piccola libreria di frammenti contro Bcl-XL utilizzando come tecnica la spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) in soluzione. Tra questi uno è risultato essere attivo con una Kd nel basso millimolare. Partendo da questo hit iniziale, abbiamo effettuato degli studi di relazione struttura-attività (SAR) di diversi analoghi, utilizzando sia esperimenti NMR che guardano alla proteina (soprattutto 2D [1H, 15N] -HSQC) ed esperimenti NMR concentrati sul ligando (Saturation Transfer Difference (STD) e waterLOGSY). I nostri studi hanno portato ad un frammento con un Kd di 811 μM calcolati utilizzando le perturbazioni di chemical shift (CSP) dagli spettri 2D [1H, 15N]-HSQC. Dagli studi di docking molecolare condotti utilizzando le informazioni di CSP sperimentalmente ottenute, ci hanno permesso di ottenere una conformazione a bassa energia del frammento finale nella tasca di legame idrofobica di Bcl-XL. La seconda parte di questa tesi riguarda CD44, una proteina che dai dati strutturali non è un target particolarmente ‘druggable’ e solo pochi agenti leganti sono noti per legarla in saggi cellulari. Per prima cosa abbiamo cercato di convalidare tali agenti leganti noti con metodi biofisici, ma sorprendentemente abbiamo trovato che, con l'eccezione di HA e un anticorpo disponibile in commercio, nessuno di questi lega apprezzabilmente la proteina ricombinante hCD44(21-178). Nel perseguire dei possibili nuovi antagonisti di CD44 abbiamo effettuato una campagna di screening di frammenti sulla proteina 15N-hCD44(21- 178) utilizzando esperimenti NMR 1D 1H-alifatici e 2D [1H, 15N]-sofastHMQC come metodi di rilevamento. Abbiamo trovato due hit iniziali strutturalmente affini e partendo da questi abbiamo effettuato ulteriori studi utilizzando analoghi disponibili in commercio. Questi esperimenti hanno portato in un frammento con una costante di dissociazione calcolata con la perturbazione di chemical shift dagli esperimenti 2D [1H, 15N]-sofastHMQC di 7,43 mM. In conclusione Bcl-XL e CD44 sono entrambe sovraespresse in molti tipi di cellule tumorali. Per questo motivo trovare agenti leganti capaci di inibire queste due proteine è un compito molto attraente per lo sviluppo di nuovi chemioterapici. Utilizzando un approccio NMR basato sui frammenti, abbiamo trovato per entrambi i target due hit che potrebbero essere la base per ulteriori studi di evoluzione del frammento per lo sviluppo di composti lead più potenti.