Biopolymer production from agro-industrial wastes: bacterial strains selection and genetic improvement.

This work is included in a wider research program carried out at the Dipartimento di Agronomia Animali Alimenti Risorse Naturali e Ambiente (DAFNAE) within the EU project ANIMPOL (Biotechnological conversion of carbon containing wastes for eco‐efficient production of high added value products). The aim of the entire project was to produce high-added-value products using inexpensive agricultural by-products as carbon source. The fatty by-products from slaughterhouses have been adopted for its conversion into biopolymers such as polyhydroxyalkanoates (PHA) by properly selected and/or developed microbes. In more detail the objective of this research was to look for, select and characterise bacterial strains able to utilise, as carbon source, low cost industrial lipid wastes such as triacylglycerols (TAGs) from animal fats, with the final goal to produce PHAs. For this reason lipolytic bacteria were isolated from a variety of different environments, such as soil or waste water of a slaughterhouse. Several bacterial strains were found to possess remarkable lipolytic activities but not efficient PHAs production capabilities. As a consequence, a molecular biology program started in order to obtain a microbial strain capable of both hydrolysing lipids and producing high levels of PHAs. Delftia acidovorans DSM39, a well-known producer of PHAs with high molar fractions of 4-hydroxybutyrate (4HB), although unable to metabolize lipids, was selected as host strain. On the other hand, Pseudomonas stutzeri BT3, the most efficient lipase producer among the obtained isolates, was designated as potential donor of lipolytic genes. The lipC and lipH sequences of P. stutzeri BT3 were successfully co-expressed into D. acidovorans DSM39 and the resulting recombinant strain displayed high extracellular enzymatic activity on corn oil. The PHAs production from corn oil achieved high levels (26% of cell dry weight, with about 7% of 4HB). Surprisingly, the recombinant strain produced greater values directly from slaughterhouse residues such as udder and lard (43 and 39%, respectively, with almost 7% of 4HB). Moreover, this work proved the ability of the recombinant D. acidovorans DSM39 strain to produce PHAs with significant percentage of 4HB, without the supplementation of any precursor in the liquid broth. This research paves the way to the efficient one-step conversion of fatty residues into PHAs having valuable properties exploitable in several medical and industrial applications.

Questo lavoro è inserito in un ampio programma di ricerca svolto presso il Dipartimento di Agronomia Animali Alimenti Risorse Naturali e Ambiente (DAFNAE), nell'ambito del progetto europeo ANIMPOL (Biotechnological conversion of carbon containing wastes for eco‐efficient production of high added value products). Lo scopo dell'intero progetto era di ottenere prodotti ad alto valore aggiunto utilizzando sottoprodotti agricoli a basso costoso, come fonte di carbonio. I grassi, sottoprodotti dell’industria della lavorazione della carne, sono stati utilizzati per la conversione in biopolimeri, come poilidrossialcanoati (PHA), da parte di microbi adeguatamente selezionati e /o ricombinanti. In particolare, l'obiettivo di questa ricerca è stato quello di cercare, selezionare e caratterizzare ceppi batterici in grado di utilizzare, come fonte di carbonio a basso costo, trigliceridi derivati da grassi animali, con l'obiettivo finale di produrre PHA. Per questo motivo, batteri lipolitici sono stati isolati da differenti nicchie ecologiche, come suolo o acque reflue di un macello. Diversi ceppi batterici hanno dimostrato notevoli attività lipolitiche ma non efficienti capacità di produrre PHA. Di conseguenza è stato avviato un programma di biologia molecolare per ottenere un ceppo microbico capace di idrolizzare i trigliceridi e di usarli per produrre elevati livelli di PHA. Delftia acidovorans DSM39, noto produttore di PHA con consistenti frazioni molari di 4-idrossibutirrato (4HB), è stato selezionato come ceppo ospite, anche se incapace di metabolizzare i lipidi. Pseudomonas stutzeri BT3, selezionato per la sua elevata attività lipolitica tra gli isolati microbici ottenuti, è stato designato come potenziale donatore di geni lipolitici. Le sequenze codificanti per i geni della lipasi lipC e lipH di P. stutzeri BT3 sono state co-espresse con successo in D. acidovorans DSM39. Il risultante ceppo ricombinante ha dimostrato promettenti attività enzimatiche extracellulari a partire da olio di mais. La produzione di PHA da olio di mais ha raggiunto livelli elevati (26 % del peso secco cellulare, con circa il 7% di 4HB). Sorprendentemente, il ceppo ricombinante ha prodotto valori nettamente superiori utilizzando direttamente, come fonte di carbonio, scarti di macello quali grasso di mammella bovina e lardo (43 e 39 %, rispettivamente, con quasi il 7 % di 4HB). Inoltre, questo lavoro ha dimostrato la capacità del ceppo ricombinante D. acidovorans DSM39 di produrre PHA con percentuale significativa di 4HB, senza l’impiego, nel liquido colturale, di specifici precursori. In base ai risultati preliminari finora conseguiti, questo studio rappresenta un primo passo verso lo sviluppo di microrganismi idonei alla conversione one-step di sottoprodotti lipidici in PHA con promettenti proprietà chimico-fisiche sfruttabili in numerose applicazioni mediche e industriali.