Star-like guanidyl-oligosaccharidic polymer as a new nanoplatform for sirna delivery towards cancer cells

Gene therapy is defined as the treatment or prevention of human diseases by introduction of new genetic material, such as therapeutic oligonucleotides (e.g. siRNA, miRNA, etc.), into specific cells.1 In the last few decades the research community has invested substantial resources in the delivery of therapeutic oligonucleotides (ONs). Unfortunately, due to their anionic nature, high molecular weight and structural fragility, ON administration suffers from poor bioavailability and biological efficiency. In fact, these macromolecules may undergo fast degradation by serum nucleases, negligible transmembrane transport, off-target profile and also elicit immunogenic response.2 So far, cationic nanocarriers (including polymers and lipids) represent the most promising strategies to protect and deliver ONs. In this work, we have designed a novel cationic polymer for ON (i.e. siRNA) complexation driven by coulombic interactions. Starting from an oligosaccharide (maltotriose) we synthesize through a multistep protocol a star-like molecule (Agm6-M-COOH) using Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) which was then conjugated to polyethylene glycol (PEG) to improve the biocompatibility of the system (Agm6-M-PEG). Complexes, here referred as polyplexes, were prepared by self-assembly of the cationic polymer with a model ON. The obtained polyplexes have been found to improve the pharmacokinetic and pharmacodynamics parameters of ONs generating a valuable tool for cancer treatment. Electrophoresis gel shift assay was used to investigate polyplexes formation at different nitrogen/phosphate (N/P) ratios starting from 0.5 up to 5. A complete complexation of the siRNA was achieved at the N/P ratio of 3. The interaction thermodynamic between the cationic polymer and ONs was explored by Isothermal Titration Calorimetry (ITC). The polyplexes were characterized by Dynamic Light Scattering (DLS) showing a mean size in the range of 50-75 nm and a surface charge in the range from -5 mV to +11 mV depending on the N/P ratio. A narrow polydispersity index (PDI) was observed confirming that polyplexes formulations were monodispersed. Polyplexes formed at N/P ratio 3 and 5 showed the most performing physico-chemical features and were thus further characterized and tested in vitro. Morphological analysis of these formulations were performed by Transmission Electron Microscopy (TEM) showing a rod-shape particles. Moreover, polyplexes showed also a satisfactory serum stability and remarkable siRNA protection from nucleases. The strength and the stability of the polymer/siRNA interaction was confirmed by the heparin displacement test performed by electrophoresis. In fact, 2.5 IU/mL heparin concentration, about 16 fold higher compared to the heparin concentration in blood (0.15 IU/mL4) was required to achieve total siRNA displacement from polyplexes. Preliminary in vitro studies were performed on human MCF-7 breast adenocarcinoma cells, human KB cervical carcinoma cells and murine MC3T3-E1 embryonic fibroblast showing a good biocompatibility and cell uptake of the polyplexes. In addition, the different composition and structure of the polyplexes was also found to affect the cell up-take: polyplexes with smaller aspect ratio were taken up more efficiently than polyplexes with larger aspect ratio. The hemolytic activity was also assessed by measuring red blood cells (RBCs) lysis and negligible hemolysis was observed for both the formulations tested. To enhance the site-selectivity of the system, targeted polyplexes towards tumor cells were formulated. To this aim, the cationic polymer was functionalized at one end-chain with folic acid (Agm6-M-PEG-FA). The silencing activity of polyplexes decorated with different amount of folic acid was evaluated and polyplexes formed with 25 %w/w of Agm6-M-PEG-FA were found possesses the better activity. In this contest, a comparative study between folate and non-folate polyplexes was performed. Aiming at identify the best in vitro and in vivo model, several cell lines were screened for the expression of the folate receptor finally selecting the human MDA-MB-231 breast adenocarcinoma cells. Silencing and toxicity studies of polyplexes were then performed on HeLa and MDA-MB-231 cells. For this purpose, siRac1 was used as a therapeutic siRNA for its ability to inhibit cell migration, metastatization and cell invasion3. The folate and non-folate polyplexes were found highly biocompatible (cell viability >80% for all the concentration tested assessed by MTT assay) and immuno-compatible (assessed by immune stimulation). Folate-targeted polyplexes showed a gene silencing about two folds higher compared to non-folate polyplexes (86% and 53%, respectively). The ability of the polyplexes to inhibit cell migration was assessed by wound healing assay. The gap closure was observed after 12 hours and the results showed a 40% inhibition of the cell migration when cells were treated with 500 nM siRNA equivalent dose for folate polyplexes. On the contrary, non-folate polyplexes inhibited cell migration of only 10%. Despite the different silencing activity and inhibition of cell migration, no relevant differences in the cell uptake were observed between the targeted and non-targeted system by confocal analysis. Intracellular trafficking studies were then performed. Folate-targeted polyplexes were found in the cytoplasm and did not co-localize with early endosomes and lysosomes. Conversely, non-folate polyplexes fully co-localized with early endosomes. The cell internalization mechanism was also evaluated by immunostaining the caveolin-1 and clathrin heavy chain, responsible for the caveolae and clathrin-mediated uptake, respectively. Caveolae- mediated internalization was observed for folate-targeted polyplexes while a clathrin-mediated mechanism was assessed for non-targeted polyplexes. These results highlighted the folic acid involvement on the caveolae mediated uptake which was found to enhance the gene silencing activity. Finally, the systemic toxicity of folate and non-folate polyplexes using a siRNA concentration ranging from 1 to 6 mg/kg was evaluated on Nu/Nu female mice by stepwise escalation dose administered by intravenous injection until the maximum tolerated dose for short period. No toxicity was found for all the doses used for both formulations. Finally, folate polyplexes accumulation in the tumor was investigated observing a ~500-fold and ~65-fold increase of Rac1 siRNA tumor accumulation in comparison with saline or scramble siRNA (siEGFP) treatment, respectively. It was possible to detect a linear correlation between the size of the tumor and the polyplexes accumulation. Histologic studies confirmed the accumulation in the tumor tissue.

La terapia genica viene definita come il trattamento o la prevenzione di malattie umane attraverso l’introduzione all’interno di cellule specifiche di nuovo materiale genetico quali gli oligonucleotidi terapeutici (siRNA, miRNA etc.)1. Negli ultimi decenni, molti ricercatori hanno investito nello sviluppo in sistemi di delivery di oligonucleotidi terapeutici (ONs). Tuttavia, la somministrazione di ONs risulta difficile e si osserva una bassa biodisponibilità ed efficacia biologica data la loro natura anionica, l’elevato peso molecolare e le fragilità strutturali. Queste macromolecole, subiscono una rapida degradazione da parte delle nucleasi del siero, possiedono un trascurabile trasporto transmembrana, possono accumularsi in maniera aspecifica e stimolare il sistema immunitario2. Nanocarrier cationici (ad esempio polimeri e lipidi) rappresentano una delle più promettenti strategie per proteggere e trasportare ONs all’interno di cellule malate. In questo lavoro, è stato disegnato un nuovo un nuovo polimero cationico per la complessazione di siRNA basata su interazioni di tipo colombiano (attrazione di carica). Partendo da un oligosaccaride (il maltotriosio) una molecola dalla struttura a stella è stata sintetizzata (Agm6-M-COOH) tramite un protocollo multi-step utilizzando una polimerizzazione a trasferimento atomico radicale (ATRP). A questa molecola è stata quindi coniugata una catena di glicole polietilenico (PEG) al fine di aumentare la biocompatibilità del sistema (Agm6-M-PEG). I complessi, che normalmente vengono chiamati “poliplessi”, sono stati preparati per auto assemblaggio tra il polimero cationico e ONs. I poliplessi hanno dimostrato migliorare i parametri farmacocinetici e farmacodinamici degli ON generando un interessante modello per la terapia antitumorale. I saggi elettroforetici sono stati impiegati per valutare la formazione dei poliplessi a diversi rapporti azoto/fosforo (N/P ratio) partendo da 0.5 fino a 5. La completa complessazione del siRNA è stata ottenuta a valori di N/P ratio pari a 3. Le interazioni termodinamiche tra il polimero cationico e ONs sono state esplorate attraverso la calorimetria a titolazione isotermica (Isothermal Titration Calorimetry, ITC). I poliplessi sono stati caratterizzati tramite Dynamic Light Scattering (DLS) mostrando un dimensione media nel range di 50-75 nm e una carica superficiale in un intervallo di valori da -5 mV a +11 mV in funzione del rapporto N/P. Un basso indice di polidispersione è stato osservato, confermando che le formulazioni sono monodisperse. I poliplessi aventi 3 e 5 N/P ratio hanno mostrato possedere le migliori caratteristiche fisico-chimiche e sono stati ulteriormente caratterizzati e testati in vitro. Le analisi morfologiche delle formulazioni sono state effettuate attraverso la microscopia elettronica a trasmissione. Da tale analisi si è osservato che le particelle possiedono una struttura a bastoncello. I poliplessi inoltre hanno evidenziato la capacità di proteggere siRNA dalle nucleasi e una buona stabilità in siero. La forza dell’interazione tra il polimero e il siRNA e la stabilità dei poliplessi è stata ulteriormente confermata via elettroforesi attraverso il test di spiazzamento con eparina. Infatti, il totale spiazzamento di siRNA dal complesso avviene solo a concentrazioni di eparina pari a 2.5 IU/mL, circa 16 volte superiori rispetto a quelle presenti nel torrente ematico (0.15 IU/mL). Studi preliminari in vitro sono stati effettuati su cellule MCF-7 di adenocarcinoma mammario umano, cellule KB di carcinoma della cervice uterina umana e cellule MC3T3-E1 di fibroblasti di embrioni murini e hanno mostrato una buona biocompatibilità e uptake cellulare. Inoltre, è stato osservato come la differente composizione e struttura dei poliplessi influenzi l’uptake cellulare: i poliplessi con un aspect ratio più piccolo sono internalizzati più efficientemente rispetto ai poliplessi che presentano un aspect ratio maggiore. L’attività emolitica dei poliplessi è stata presa in considerazione misurando l’effetto dei poliplessi sui globuli rossi del sangue. Dai test efettuati è emerso un trascurabile effetto emolitico per entrambe le formulazioni in analisi. Al fine di aumentare la sito-selettività del sistema, i poliplessi sono stati successivamente formulati al fine di essere direzionati contro cellule tumorali. Per questa ragione, il polimero cationico è stato funzionalizzato alla fine della catena con acido folico (Agm6-M-PEG-FA). L’attività di silencing dei poliplessi decorati con diverse quantità di acido folico è stata valutata utilizzando siRac1. Dallo studio è emerso che i poliplessi costituiti con il 25% w/w di Agm6-M-PEG-FA sono risultati i più efficienti nella riduzione dell’espressione di Rac1. In questo contesto, uno studio comparativo tra poliplessi aventi 25%w/w di polimero derivatizzato con acido folico e poliplessi senza acido folico è stato intrapreso. Al fine di individuare il miglior modello in vitro e in vivo, è stato fatto uno screening di diverse linee cellulari per valutare l’espressione del recettore dell’acido folico e le cellule MDA-MB-231 di adenocarcinoma mammario sono state selezionate come quelle a maggior espressione. Studi di silenziamento e tossicità da parte dei poliplessi sono stati effettuati. Per questo motivo, siRac1 è stato utilizzato come siRNA terapeutico per le sue capacità di inibire la migrazione cellulare, la formazione di metastasi e l’invasione cellulare3. I poliplessi con e senza acido folico hanno mostrato un’elevata biocompatibilità (maggiore dell’80% per tutte le concentrazioni testate con il saggio MTT) e una elevata immuno-compatibilità (valutata attraverso stimolazione del sistema immunitario). I poliplessi direzionati con acido folico hanno mostrato un miglior gene silencing di circa due volte superiore rispetto ai poliplessi non direzionati (86% e 53% rispettivamente). L’abilità dei poliplessi di inibire la migrazione cellulare è stata osservata attraverso il saggio di wound healing. La chiusura del “taglio” è stata osservata dopo 12 ore e i risultati hanno mostrato un’inibizione del 40% della migrazione cellulare dopo trattamento con una dose equivalente di siRNA pari a 500 nM di poliplessi decorati con acido folico. Al contrario, poliplessi non decorati inibiscono la migrazione solo del 15%. Nonostante la differente attività di silencing e di inibizione della migrazione cellulare, non sono state osservate differenze di internalizzazione tra i poliplessi con e senza acido folico con analisi confocale e Imagestream. Pertanto, studi di traffiking intracellulare sono stati eseguiti. Poliplessi portanti acido folico sono stati osservati nel citoplasma e nessuna co-localizzazione con endosomi e lisosomi è stata osservata. Al contrario, poliplessi non portanti acido folico sono stati visualizzati all’interno di entrambi i compartimenti cellulari. I meccanismi di internalizzazione cellulare sono stati valutati attraverso la marcatura di caveolin-1 e di clathrin heavy chain attraverso anticorpi. L’internalizzazione caveolae-mediata è stata osservata per i poliplessi con acido folico mentre per i poliplessi senza acido folico un meccanismo di endocitosi mediato da clatrine è stato osservato. Questi risultati evidenziano un coinvolgimento dell’acido folico nel processo di uptake mediato da caveolae che è stato visto incrementare l’attività di silenziamento genico. La tossicità sistemica dei poliplessi con e senza acido folico è stata studiata su femmine di topo Nu/Nu usando dosi equivalenti di siRNA nell’intervallo di 1-6 mg/kg. L’obiettivo di questo test è di raggiungere la massima dose tollerata attraverso una crescente somministrazione di siRNA. Tuttavia nessuna tossicità è stata ottenuta per entrambe le formulazioni. Infine, è stato studiato in vivo l’accumulo dei poliplessi con acido folico. Da questo studio si è osservato un accumulo di Rac1 rispetto alla soluzione salina o a un siRNA non codificante (siEGFP) di circa 500 e 65 volte rispettivamente. Inoltre è stato possibile individuare una correlazione tra le dimensioni del tumore e l’accumulo dei poliplessi. Studi istologici hanno confermato l’accumulo dei poliplessi nel tessunto tumorale.