Estrogen immunomodulation in systemic autoimmunity: evidences in in vitro models on a human myeloid cell line

Background: Estrogens have an important role in determining immune system development, regulation and response to stimuli. Estrogens also influence pathogenesis and progression of autoimmune diseases, including Systemic Lupus Erythematosus (SLE), where there is a strong sex bias: female to male prevalence ratio is about 9:1. Estrogens, and in particular 17-β estradiol (E2), act as transcription factor through the binding to its specific receptors, ERα and ERβ. Among genes regulated by E2, Interferon α (IFNα) and B Lymphocyte Stimulator (BLyS) seem to be affected, and BLyS seems to be an IFN-inducible gene. Both cytokines are increased in SLE patients, indicating a link between hormones and cytokines induction in autoimmunity; BLyS over-expression can represent also a sign of the so called “IFN signature” characterizing systemic autoimmune diseases. Objective: The aim of the present study was to evaluate the effects of E2 on BLyS mRNA and protein expression in a human myeloid cell line, in order to propose an in vitro model of estrogen systemic immunomodulation, also considering IFNα as a possible mediator of this signaling pathway. Materials and Methods: U937 monocytes and U937-derived macrophages (treated with 50ng/mL Phorbol 12-Myristate 13-Acetate for 72 hours, Sigma-Aldrich) were exposed to E2 (Sigma-Aldrich) 100nM, 10nM, 1nM or 0.1nM. Cell viability was evaluated with Trypan Blue and Burker Chamber cell counting. Total RNA was extracted after 6, 24 and 48 hour administration, and culture medium was collected for protein quantification. Quantitative PCR was performed for BLyS and IFNα genes. GAPDH was used as reference gene. Primer concentration was 100nM and cDNA quantity was 25ng. Data were analyzed with 2-ΔΔCt method and statistical analysis was performed with REST-384© version 2 using Pair Wise Fixed Reallocation Randomisation Test©. ELISA assay, using a commercially available kit “Quantikine® ELISA” for Human BAFF/BLyS/TNFSF13B (R&D System) was performed for BLyS protein detection in culture supernatants. Data were normalized for total protein and differences in protein levels between treated and control cells during times were performed with multivariate analysis for repeated measures. The same protocols were used for treatment with exogenous human recombinant INFα (hr-IFNα, 1000IU/mL, Enzo Life Sciences), investigating BLyS mRNA expression at 6, 10, 24 and 48 hour and BLyS protein release at 6, 24 and 48 hour administration. Results: E2 did not induce any modulation of BLyS gene expression at any time or concentration used, in both monocytes and derived-macrophages. BLyS protein release was increased during time, and the highest E2 doses induced BLyS protein mobilization in monocytes, while a BLyS release was noticed in derived-macrophages starting from 1nM E2. In monocytes, E2 induced a time-dependent IFNα up-regulation especially at doses 10nM and 1nM, while in differentiated macrophages E2 induced a significant IFNα down-regulation at 24 hours at doses 100nM and 10nM. IFNα treatment induced a significant up-regulation of BLyS, both in monocytes and in derived-macrophages at any time of treatment, but the effect was higher and faster in differentiated cells than in steady-state monocytes. Regarding BLyS protein release, IFNα treatment did not induce a significant BLyS increase compared with that observed in untreated cells. Conclusion: Within 48-hour treatment E2 dose-dependently induces IFNα, but not BLyS expression, while exogenous IFNα affects BLyS transcription but not protein release. These findings suggest that estrogens could primarily have a role in the modulation of cytokines belonging to innate immunity, such as IFNα, with different effects depending on target cell phenotype and milieu. Estrogen modulation of adaptive immune response, here exemplified by BLyS, seems to be the result of estrogen-induced IFNα up-regulation, thus confirming the link between innate and adaptive immune activation in systemic autoimmunity.

Background: Gli estrogeni svolgono un ruolo importante nel determinare lo sviluppo, la regolazione e la risposta agli stimoli del sistema immunitario. Essi sono implicati anche nella patogenesi e nella progressione delle malattie autoimmuni, come il Lupus Eritematoso Sistemico (LES), dove la prevalenza delle donne sugli uomini risulta essere di 9 a 1. Gli estrogeni, ed in particolare il 17-β estradiolo (E2), agiscono come fattori di trascrizione attraverso il legame con i loro specifici recettori, ERα ed ERβ. Tra i geni regolati da E2 troviamo l’Interferone α (IFNα) e B Lymphocyte Stimulator (BLyS); BLyS sembra essere un gene indotto anche da IFNα. Entrambe queste citochine si trovano ad alti livelli nei sieri dei pazienti con LES, indicando un possibile collegamento tra ormoni e induzione citochinica nell’autoimmunità; l’over-espressione di BLyS può anche rappresentare un segnale della cosiddetta “IFN signature”, che caratterizza le malattie autoimmuni sistemiche. Obiettivo: Lo scopo del presente studio è stato quello di valutare gli effetti di E2 sull’espressione di BLyS mRNA e proteina in una linea cellulare mieloide umana, così da proporre un modello in vitro di immunomodulazione sistemica indotta da estrogeni, considerando IFNα come un possibile mediatore di questa via di segnale. Materiali e Metodi: Cellule umane U937, monocitarie e simil-macrofagiche (trattati con 50ng/mL di Forbolo 12-Miristato 13-Acetato, Sigma-Aldrich), sono state trattate con E2 (Sigma-Aldrich) alle concentrazioni 100nM, 10nM, 1nM, 0.1nM. La vitalità cellulare è stata valutata mediante conta cellulare con il colorante vitale Trypan Blue e Camera di Burker. L’RNA totale è stato estratto dopo 6, 24 e 48 ore dal trattamento, e il medium di coltura è stato raccolto per la quantificazione proteica. La PCR quantitativa (qPCR) è stata eseguita per i geni BLyS e IFNα. GAPDH è stato utilizzato come gene reference. Sono stati utilizzati i primer alla concentrazione 100nM e cDNA nella quantità di 25ng. I dati sono stati analizzati con il metodo 2-ΔΔCt e l’analisi statistica è stata eseguita con REST-384© version 2 using Pair Wise Fixed Reallocation Randomisation Test©. Per determinare la quantità di proteine nel surnatante di coltura è stato utilizzato il kit ELISA commerciale “Quantikine® ELISA” for Human BAFF/BLyS/TNFSF13B (R&D System). I livelli di BLyS proteina sono stati normalizzati per i livelli di proteine totali e le differenze nei livelli di proteina tra cellule trattate e di controllo sono stati valutati con un’analisi multivariata per misure ripetute. Gli stessi protocolli sono stati utilizzati per il trattamento con IFNα ricombinante umano esogeno (hr-IFNα, 1000IU/mL, Enzo Life Sciences), indagando l’espressione dell’mRNA di BLyS a 6, 10, 24 e 48 ore e il rilascio di BLyS proteina a 6, 24 e 48 ore dal trattamento. Risultati: E2 non induce modulazione dell’espressione genica di BLyS ai tempi e alle concentrazioni testate, sia nei monociti che nei macrofagi-derivati. I livelli di BLyS proteina nel surnatante di coltura aumentano nel tempo, le più alte dosi di E2 inducono la mobilizzazione e il rilascio di BLyS in coltura nei monociti, mentre nei macrofagi-derivati si è notato un rilascio di BLyS partendo dalla concentrazione di E2 1nM. Nei monociti E2 induce un’up-regolazione tempo-dipendente di IFNα, specialmente alle dosi 10nM e 1nM, mentre nei macrofagi differenziati E2 induce una significativa down-regolazione di IFNα a 24 ore, alle dosi 100nM e 10nM. Il trattamento con IFNα induce una significativa up-regolazione di BLyS, sia nei monociti che nei macrofagi-derivati ad ogni tempo di trattamento, ma gli effetti sono risultati più rapidi e più marcati nei macrofagi rispetto ai monociti. Per quanto riguarda il rilascio di BLyS proteina, il trattamento con IFNα non ha indotto un significativo aumento di BLyS rispetto alle cellule non trattate. Conclusioni: Entro 48 ore, il trattamento con E2 modifica in maniera dose-dipendente l’espressione di IFNα, ma non quella di BLyS, mentre IFNα esogeno influisce sulla trascrizione di BLyS, ma non sul rilascio della proteina stessa. Queste evidenze suggeriscono che gli estrogeni possono avere primariamente un ruolo nella modulazione di citochine appartenenti all’immunità innata, come l’IFNα, con effetti differenti dipendenti dal fenotipo cellulare e dal milieu citochinico. La modulazione estrogenica della risposta immunitaria adattativa, qui esemplificata da BLyS, sembra essere il risultato dell’up-regolazione di IFNα indotta da estrogeni, a conferma della stretta inter-relazione tra immunità innata e adattativa nell’autoimmunità sistemica.