Exploring Orai2 function in alzheimer's disease models based on presenilin 2 and amyloid precursor protein mutants

Alzheimer'™s disease (AD) is the most common form of dementia among elderly population. More than twenty years ago the so-called amyloid hypothesis was formulated based on the major histopathological hallmarks of AD, among which the amyloid plaques are the most known and studied. This hypothesis was prompted by the discovery of three genes that, whereas mutated, are associated with the familial forms of the disease (FAD). One of these genes encodes for the amyloid precursor protein (APP), a single-pass type I transmembrane protein that undergoes sequential cleavages operated by the secretase family of enzymes. The last and key secretase, called gamma-secretase, is composed of four proteins, among which we found either presenilin 1 (PS1) or presenilin 2 (PS2), encoded by other two genes (PSEN1/PSEN2) that are responsible for FAD pathogenesis. Autosomic dominant mutations in either APP, PSEN1 or PSEN2 cause accelerated Abeta deposition due to an increased Abeta42/Abeta40 ratio. While the vast majority of AD cases are sporadic, FAD patients bearing PS2 mutations show a clinical course much similar to that of sporadic patients. By many groups it was found that PSs are capable of perturbing cellular Ca2+ homeostasis, and, particularly, our group demonstrated that PS2, either bearing FAD-linked mutations or wild-type (WT), lowers endoplasmic reticulum (ER) and Golgi apparatus Ca2+ content, interacts with SERCA pump, dampening its function, and tethers ER and mitochondria; all of these pleiotropic effects are independent of its gamma-secretase activity. Recently another group identified PS2 as a regulator of the ER Ca2+ content, together with Orai2, a plasma membrane channel implicated in the Store-Operated Ca2+ Entry (SOCE). This latter phenomenon is impaired in AD, and specifically it is down-tuned in mutant PS-bearing cells. Taken together this body of information offered an interesting background to study the interplay between ER Ca2+ levels, SOCE defects and APP processing/Abeta production. Taking advantage of the PS2-based AD mouse models available in our laboratory, namely the homozygous single transgenic (TG) line expressing the FAD-linked mutant PS2-N141I (line PS2.30H) and the homozygous double transgenic (2TG) line expressing PS2-N141I together with the Swedish double mutant APP-K670M/N671L (line B6.152H), we could investigate the expression pattern of Orai2 in the nervous tissue. Western blot analyses on cortices and hippocampi revealed that Orai2 was overexpressed in cortices from TG and 2TG mice, when compared to C57BL/6 (WT) mice. This overexpression was mainly due to the neuronal contribution since it was even higher in cortical neuronal cultures and in situ Orai2 was found only in neurons, as assayed by immunohistochemical analysis of brain slices. Orai2 up-regulation, that is the condition found in TG and 2TG neurons, is capable of perturbing cellular Ca2+ homeostasis. Particularly, when overexpressed it caused a significant decrease in IP3-induced ER Ca2+ release in both H4-APPswe and HEK29T cells; these results are consistent with a decreased ER Ca2+ level, as measured with the ER-targeted probe G-CEPIA1er. In addition to this, Orai2 revealed to be a less efficient mediator of SOCE than Orai1, since it dampened SOCE when overexpressed alone and it produced a much smaller SOCE when overexpressed with STIM1 as compared with Orai1 plus STIM1 overexpression. Conversely to our expectations, Orai2 downregulation had a noticeable effect neither on IP3-induced ER Ca2+ release nor on total store Ca2+ content; it however improved Ca2+ entry upon store depletion. As far as subcellular localization goes, Orai2 overexpression did not increase the fraction of protein present in the ER and it appeared that most of the protein was found at the early endosomal level, as revealed by immunofluorescence staining of various subcellular compartments. This holds true moving to cortical neurons, where Orai2 was preferentially found in Rab5-EEA1 positive endosomes in primary cultures from WT mice, with a dramatic accumulation at this level in neurons from 2TG mice, possibly reflecting the increased early-endosome compartment that characterizes the AD phenotype. Orai2 localization is, however, dynamic, meaning that it moves in and out of endosomes when properly stimulating neurons with compounds able to induce neuronal activity or to stimulate SOCE. This behaviour is anyway different among the three genotypes, with TG neurons showing a greater tendency to retrieve Orai2 in endosomes upon cell stimulation, and 2TG neurons being unable to properly tune their endosome pool, possibly because of its higher accumulation level. Whether these changes involve also Orai1 has still to be evaluated and it will give us a better picture of this unknown phenomenon. Finally, evidence is provided that a down-tuning of SOCE is associated with increased levels of secreted Abeta42, as measured by ELISA performed on conditioned media from mutant APP-expressing cells such as CHO-7PA2 and H4-APPswe.

La malattia di Alzheimer (AD) costituisce la forma di demenza più comune nella popolazione anziana. Ormai più di vent'anni fa è stata formulata la cosiddetta ipotesi della cascata amiloide, la quale si basa sulle placche amiloidi, uno dei principali marker di AD, tra i più conosciuti e studiati. La formulazione di quest'™ipotesi fu permessa dalla scoperta di tre gene i quali, allorché mutati, sono associati con la forma familiare di AD (FAD). Uno di questi geni codifica per la proteina precursore dell'™amiloide (APP), la quale è una proteina di tipo I a singolo dominio transmembrana che viene tagliata in maniera sequenziale dagli enzimi della famiglia delle secretasi. L'™ultima secretasi a tagliare APP, nonché la più importante nell'™AD, è chiamata gamma-secretasi ed è composta da quattro proteine, che comprendono o la presenilina 1 (PS1) o la presenilina 2 (PS2), codificate dagli altri due geni (PSEN1/PSEN2) responsabili della patogenesi di FAD. Mutazioni autosomiche dominanti in APP, PSEN1 o PSEN2 causano una deposizione più veloce di Abeta dovuta ad un aumentato rapporto Abeta42/Abeta40. La maggior parte dei casi di AD, tuttavia, è sporadica; i pazienti FAD con mutazioni in PS2 mostrano un decorso clinico della malattia molto più simile a quello dei pazienti sporadici. Molti gruppi di ricerca hanno dimostrato la capacità delle PSs di perturbare l'™omeostasi cellulare del Ca2+, e in particolare il nostro gruppo ha dimostrato che PS2, sia nella forma mutata associata a FAD che nella forma wild-type (WT), abbassa il contenuto di Ca2+ del reticolo endoplasmatico (ER) e dell'apparato di Golgi. Inoltre essa interagisce con la pompa SERCA, diminuendone il funzionamento, e modula la vicinanza fra ER e mitocondri; tutte queste funzioni pleiotropiche sono indipendenti dalla sua attività gamma-secretasica. Recentemente un altro gruppo ha identificato PS2 come un regolatore del contenuto di Ca2+ del ER, insieme ad Orai2, il quale è un canale della membrana plasmatica implicato nell'™entrata di Ca2+ dipendente dallo svuotamento del ER (SOCE). Quest'™ultimo fenomeno è alterato nell'AD, e in particolare è ridotto nelle cellule che esprimono PS mutate. Questa serie di informazioni rappresenta una base interessante per lo studio dell'™interazione fra contenuto di Ca2+ del ER, diminuzione di SOCE e metabolismo di APP/produzione di Abeta. Grazie ai modelli murini di AD basati su PS2 presenti in laboratorio, specificatamente il modello singolo transgenico (TG), esprimente il mutante FAD PS2-N141I (linea PS2.30H) e il modello doppio transgenico (2TG), esprimente PS2-N141I insieme al mutante Swedish APP-K670M/N671L (linea B6.152H), abbiamo potuto investigare il pattern di espressione di Orai2 nel tessuto nervoso. Nei Western blot di cortecce ed ippocampi abbiamo notato come Orai2 sia sovra-espressa nella corteccia dei topi TG e 2TG se confrontati con topi di controllo C57BL/6 (WT). Quest'aumento di espressione è dovuto principalmente ad un contributo neuronale, sia in quanto è maggiore in colture neuronali pure, sia perché Orai2 è presente solamente nei neuroni in situ, come rivelato dall'analisi immunoistochimica di fettine di cervello. L'™aumentata espressione di Orai2, così come si ritrova nei neuroni TG e 2TG, è in grado di alterare l'™omeostasi cellulare del Ca2+. In particolare, quando sovra-espressa, Orai2 causa una riduzione significativa del rilascio di Ca2+ indotto da IP3, sia in cellule H4-APPswe che HEK293T; questi risultati sono in accordo con una riduzione del contenuto di Ca2+ del ER, condizione osservata utilizzando la sonda G-CEPIA1er, direzionata al ER. Inoltre, Orai2 si è rivelato essere un mediatore di SOCE meno efficiente di Orai1, infatti diminuisce SOCE quando espresso da solo e, se co-espresso con STIM1, dà vita ad un SOCE meno ampio di quello prodotto da Orai1 co-espresso con STIM1. Contrariamente a quanto atteso la riduzione di Orai2 non produce alcuna diminuzione né del rilascio di Ca2+ indotto da IP3, né del contenuto totale di Ca2+ dei depositi intracellulari; essa tuttavia produce un lieve aumento dell'™ingresso di Ca2+ causato dalla deplezione dei depositi. Per quanto riguarda la localizzazione subcellulare, la sovra-espressione di Orai2 non aumenta la frazione di questa proteina presente nel ER, la maggior parte di Orai2 è infatti presente a livello degli 'early endosomes', come dimostrato marcando numerosi compartimenti subcellulari in immunofluorescenza. Ciò resta vero anche nei neuroni corticali in coltura. Nei neuroni WT, Orai2 si trova preferenzialmente negli endosomi positivi per Rab5 ed EEA1, a questo livello la localizzazione aumenta nei neuroni 2TG, un accumulo causato probabilmente dall™aumento degli 'œearly endosomes' tipico del fenotipo AD. Nonostante sia presente a livello endosomiale, la localizzazione di Orai2 è dinamica, e cioè cambia fra dentro e fuori dagli endosomi a seconda dello stimolo usato per aumentare l'™attività neuronale o per indurre SOCE. Questo dinamismo appare diverso fra i tre genotipi, dove i neuroni TG mostrano una maggior tendenza ad accumulare Orai2 negli endosomi dopo stimolazione della cellula, mentre i neuroni 2TG risultano incapaci di modulare questo aspetto, probabilmente perché in queste cellule l'™accumulo di endosomi è prossimo alla saturazione. Resta da valutare se questi cambi di localizzazione interessano anche Orai1, un'™informazione che ci permetterà di avere un'™idea più precisa di questo fenomeno sconosciuto. Infine vi è evidenza che la diminuzione di SOCE è associata ad un aumento dei livelli di Abeta42 secreta, così come misurato tramite saggio ELISA sui terreni condizionati provenienti da cellule che esprimono una forma mutata di APP, quali le CHO-7PA2 e le H4-APPswe.