Biocompatible modular nanovectors for anticancer drug delivery and controlled release

The research project of this PhD thesis was focused on the design and development of innovative “smart” nanosystems for a controlled anticancer drug delivery. Smart drug delivery systems have emerged as a strategy to achieve enhanced site-specific drug accumulation and control release within the desired tissue, thus offering the opportunity to reduce systemic side effects caused by an unspecific drug biodistribution. Among the several colloidal systems available, polymeric micelles formed by amphiphilic polyaminoacidic block copolymers are gaining relevance for therapeutic application as they offer significant advantages such as improved water solubility of lipophilic drugs, enhanced drug bioavailability, high biocompatibility and versatility. For this purpose, a library of amphiphilic di-block copolymers able to self-assemble in colloidal systems for the intracellular delivery of doxorubicin was designed. The copolymer composition was engineered in order to include aminoacids with peculiar function yielding a smart material. The di-block copolymer backbone was composed by a hydrophilic block of polyethylene glycol and an amino acid-based block including different ratios of γ-hydrazinamide-glutamic acid (hydGlu) and leucine (Leu). In particular, hydGlu was selected for the conjugation of doxorubicin through a pH-cleavable hydrazone bond endowing the system a controlled drug release in the intracellular acidic compartments upon cancer cell uptake. Leucine was used as a spacer between the glutamic units to minimize the steric hindrance of the conjugated anticancer drug and promote the polymer self-assembly, in virtue of its hydrophobicity. Doxorubicin was selected for a double purpose: firstly, for its well-known anticancer activity and, secondly, together with Leucine, to to actively contribute to the block copolymer self-assembling process. The library of amphiphilic di-block copolymers was synthetized through Ring Opening Polymerization using a polyethylene glycol bearing a terminal reactive amino group (mPEG5kDa-NH2) as macroinitiator and N-carboxy anhydride aminoacids as monomers. The library was characterized by an increased leucine content with respect to glutamic acid in order to understand the effect of different aminoacid ratios in terms of doxorubicin conjugation efficiency and particle stability and select the best candidate for in vitro and in vivo studies. At first, mPEG5kDa-OH was converted in mPEG5kDa-NH2 through a radical addiction of cysteamine. N-carboxy Anhydride analogues (NCA) of γ-benzyl glutamic acid and leucine were synthetized by reaction with triphosgene. Consequently, mPEG5kDa-NH2 was used as macroinitiator for the polymerization of NCA monomers, yielding four mPEG5kDa-b-(γ-benzyl- Glun-r-Leum) polymers with γ-benzyl glutamic acid:leucine ratios of 16:0, 8:8, 6:10, 4:12. Afterwards, the γ-benzyl ester protecting group of glutamic acid of the copolymers library was removed by direct reaction with hydrazine hydrate, leading to the formation of γ-hydrazide glutamic acid moieties with a 99% conversion yield. This procedure provided four mPEG5kDa- b-(γ-hyd-Glun-r-Leum) derivatives. Finally, the conjugation of doxorubicin through the pH- sensitive hydrazone bond formation was performed for the four di-block copolymers, obtaining a high drug conjugation yield for the di-block copolymers bearing leucine as a spacer along the polyaminoacidic block. The self-assembling of the drug conjugated copolymers was achieved by a dialysis process, and the generated colloidal systems were characterized by dynamic light scattering, zeta potential, transmission electron microscopy and critical micelle concentration. The analyses revealed that the doxorubicin-conjugated copolymers assembled in spherical shape and neutral charged systems with a size of nearly 20 nm, highlighting the important role of doxorubicin and leucine as driving forces for the hydrophobic core formation. Furthermore, these analyses confirmed that the nanovectors possessed suitable features for the selective tumor accumulation exploiting the EPR effect. The low CMC values obtained for the colloidal systems would provide a remarkable stability and prevent the dissociation of the nanosystems upon injection in the bloodstream. Doxorubicin conjugation increased the polyaminoacidic block hydrophobicity leading to a stronger micelles cohesion and a reduction of copolymers concentration required for the self-assembling process. In virtue of the pH-cleavable hydrazone bond between doxorubicin and the copolymers backbone, the nanosystems were expected to selectively release the drug at acidic condition. In fact, the nanocarriers showed a faster release at pH 5.5 with respect to the blood mimicking condition, leading to a sustained and controlled release of doxorubicin from the nanocarriers in acidic intracellular compartments while preventing drug dissociation in the bloodstream. The cytotoxicity of the colloidal formulations was tested on two cancer cell lines, CT26 murine colorectal carcinoma and 4T1 murine mammary carcinoma. The doxorubicin conjugated colloidal formulations showed a dose dependent cytotoxicity on both cell lines, revealing IC50 values comparable with the ones obtained by incubation with the free doxorubicin. Furthermore, confocal analyses on CT26 cell lines were performed to assess the intracellular fate of the drug loaded formulations, and the results confirmed the lysosomal entrapment and the selective intracellular release of doxorubicin. Based on these evidence, the antitumor efficacy of the system was evaluated in vivo on CT26 and 4T1 subcutaneous tumor model. The studies were performed evaluating both the intratumoral and the intravenous administration routes. The drug-conjugated formulation bearing the 6:10 glutamate:leucine ratio was selected for this purpose since it was the most performing in terms of drug release and cytotoxic activity. When administered in vivo to CT26 and 4T1 tumor bearing mice, the drug loaded nanovectors displayed an excellent safety profile and efficient tumor volume reduction activity, leading to prolonged survival rates of the animals.

Il presente progetto di ricerca si è focalizzato sulla progettazione e lo sviluppo di un nanosistema innovativo ed intelligente per il rilascio direzionato e controllato di farmaci antitumorali. In quest’ottica, i nanosistemi “smart” per il direzionamento di farmaci possono rivestire un ruolo fondamentale grazie al loro accumulo sito-specifico ed il rilascio controllato di molecole attive, offrendo così la possibilità di ridurre gli effetti collaterali causati da una biodistribuzione incontrollata del farmaco e di migliorare la qualità di vita del paziente. Tra i vari sistemi colloidali disponibili in campo farmaceutico, le micelle polimeriche formate da copolimeri anfifilici poliaminoacidici offrono peculiari vantaggi come un aumento della solubilità di farmaci lipofili in acqua, una maggiore biodisponibilità, un'elevata biocompatibilità e versatilità. A tale scopo è stata progettata una libreria di copolimeri anfifilici per il delivery intracellulare di Doxorubicina (Doxo) in grado di auto-assemblarsi in sistemi colloidali. Il backbone polimerico è composto da un blocco idrofilico di polietilenglicole (PEG) e un blocco poliaminoacidico costituito dal derivato γ-idrazinico dell’acido-glutammico (hydGlu) e da Leucina in diversi rapporti molari. In particolare, hydGlu è stato selezionato per la coniugazione di Doxo attraverso la formazione di un legame idrazonico pH-sensibile, che permette un rilascio specifico del farmaco nei compartimenti acidi intracellulari. L’aminoacido Leucina è stato utilizzato non solo come spacer tra i monomeri di acido glutammico per minimizzare l'ingombro sterico del farmaco, ma anche per promuovere l'autoassemblaggio del polimero grazie al suo carattere idrofobico. Il farmaco Doxo è stato scelto per un duplice scopo: in primo luogo, per la sua ben nota attività antitumorale e, in secondo luogo, per promuovere il self-assembling del nanosistema. La libreria di copolimeri anfifilici è stata sintetizzata attraverso la metodica di polimerizzazione “Ring Opening Polymerization” (ROP) usando un polietilenglicole funzionalizzato con un gruppo amminico terminale reattivo (mPEG5kDa-NH2) come macroiniziatore e amminoacidi in forma N- carbossi anidridica (NCA) come monomeri. Inizialmente, mPEG5kDa-OH è stato convertito in mPEG5kDa-NH2 attraverso l’addizione radicalica di cisteamina. Gli analoghi NCA degli aminoacidi γ-benzil-glutammico e Leucina sono stati sintetizzati mediante reazione con trifosgene. Successivamente, mPEG5kDa-NH2 è stato utilizzato come macroiniziatore per la reazione di polimerizzazione dei monomeri NCA, portando alla sintesi di quattro polimeri mPEG5kDa-b- (γ-benzil-Glun-r-Leum) con rapporti molari di acido γ-benzil-glutammico:Leucina di 16: 0, 8: 8, 6:10, 4:12. Successivamente, il gruppo protettore γ-benzil estereo dell'acido glutammico è stato rimosso per reazione diretta con idrazina idrata, portando alla formazione del derivato γ-idrazidico dell’acido glutammico con una resa di conversione del 99%. Pertanto, l'intera libreria di copolimeri è stata convertita nei derivati γ-idrazidici mPEG5kDa-b- (γ-hyd-Glun-r-Leum). Infine, Doxo è stata coniugata al backbone polimerico attraverso la formazione del legame idrazonico pH-sensibile, ottenendo una elevata resa di coniugazione del farmaco per i copolimeri funzionalizzati con Leucina nel blocco poliaminoacidico. I sistemi colloidali ottenuti mediante dialisi sono stati caratterizzati attraverso DLS; TEM, Potenziale Zeta, e determinazione della concentrazione micellare critica (CMC). Le analisi hanno dimostrato che i polimeri coniugati con Doxo assemblano assumendo una forma sferica con dimensione di circa 20 nm, caratteristiche ottimali per l'accumulo selettivo nel tessuto tumorale sfruttando l'effetto EPR, ed evidenziando l'importante ruolo di Doxo e Leucina nel promuovere la formazione del core idrofobico. La bassa concentrazione di CMC ottenuta per i sistemi colloidali può essere indice di una notevole stabilità del sistema e impedire la loro dissociazione nel circolo sanguigno. La coniugazione di Doxo ha apportato un aumento di idrofobicità del blocco poliaminoacidico determinando una maggiore coesione delle micelle e una riduzione della concentrazione di polimero richiesta per il self-assembling. I sistemi colloidali hanno rilasciato selettivamente il farmaco in ambiente acido, mostrando un l’idrosili del legame idrazonico più rapida a pH 5.5 rispetto alle condizioni fisiologiche. Questo si traduce in un rilascio controllato e selettivo di Doxo in compartimenti intracellulari acidi, evitando la dissociazione farmacologica nel sangue. La citotossicità delle formulazioni colloidali è stata testata sulle linee cellulari tumorali murine CT26 e 4T1, rispettivamente carcinoma del colon-retto e carcinoma mammario. Le formulazioni colloidali hanno riportato una citotossicità dose-dipendente su entrambe le linee cellulari, con valori di IC50 paragonabili a quelli ottenuti mediante incubazione con il solo farmaco di riferimento. Inoltre, sono state eseguite analisi di microscopia confocale sulla linea cellulare CT26 per valutare il destino intracellulare del sistema micellare, confermando l’accumulo lisosomiale e il rilascio selettivo intracellulare di Doxo. Sulla base di queste evidenze, l'efficacia antitumorale del sistema è stata valutata in vivo su modelli animali di tumore sottocutaneo. Gli studi sono stati condotti valutando sia la via di somministrazione intratumorale che quella endovenosa. La formulazione contenente il farmaco caratterizzata dal rapporto molare Glutammato:Leucina di 6:10 è stata selezionata per questo scopo poiché si è rivelata la più performante in termini di rilascio di farmaco ed attività citotossica. Gli studi in vivo hanno confermato l’efficienza del sistema micellare in termini di riduzione del volume della massa tumorale, un prolungamento della sopravvivenza degli animali trattati e una tossicità trascurabile sia conseguente a trattamento locale che sistemico.