Sviluppo ed applicazioni biomediche di sistemi nanostrutturati superparamagnetici costituiti da maghemite (SAMN, Surface Active Maghemite Nanoparticles) e bioelementi

With the rapid development of nanotechnology, magnetic nanoparticles are currently being widely studied. It has long been known that the physico-chemical properties of magnetic nanoparticles can be vastly different from those of the corresponding bulk material. In particular, nanoparticles characteristics are: large surface-to-volume ratio, high surface reaction activity, high catalytic efficiency, and strong adsorption ability, which are helpful for the immobilization of desired biosensing molecules. The nanoparticles used in the present research project (called surface active maghemite nanoparticles, SAMN), were synthesized by a new simple method and original procedure in the dimension range around 10 nm, and are characterized by specific chemical behavior without any superficial modification or coating derivatization. These magnetic nanoparticles show high average magnetic moment and superparamagnetic properties, which means that, the particles are attracted by an external magnetic field, but retain no residual magnetism at field removal. Therefore, suspended superparamagnetic particles can be removed from the suspension using an external magnet, but they do not form aggregates after removal of the external magnetic field. An international patent, supported by the University of Padova, was applied about the synthetic method and further applications. Material characterization was carried out by transmission electron microscopy, spectrophotometric and spectrofluorimetric assays, Mossbauer and FTIR spectroscopy, SQUID magnetic measurements in the temperature range 2-300 K and X-ray powder diffraction studies (Acta Biomaterialia, 2012), in collaboration with the Department of Chemical Sciences and the Department of Geo Sciences of the University of Padova and the Centre for Nanomaterial Research at the Palacky University in Olomouc (Czech Republic). The surface of these maghemite nanoparticles was functionalized with proteins of high biotechnological interest, such as horseradish peroxidase, avidin and biotin to combine the advantages of immobilized proteins on nano-materials and easy operation of magnetic nanoparticles. This nanostructured magnetic nanoparticle-bioelement system was used to develop inexpensive, simple and rapid methods to purify proteins, immobilize enzymes for applications in clinical diagnostics, and biosensor development. In particular, the SAMN@avidin complex was used to purify biotinylated recombinant protein, namely human sarcoplasmic (SERCA-1A) Ca2+-ATPase, expressed in S. Cerevisiae. This macromolecule is a membrane protein, abundantly present in skeletal muscles where it functions as an indispensable component of the excitation-contraction coupling. The transporter serves as a prototype of a whole family of cation transporters, the P-type ATPases, which in addition to Ca2+ transporting proteins count Na+,K+-ATPase and H+,K+-, proton- and heavy metal transporting ATPases as prominent members. The purification procedure was aimed to produce SERCA 1a crystals, in order to determine, by x-ray crystallography, the 3D structure of this calcium ATP-ase, helping to elucidate important aspects of pump activity and regulation. Furthermore, the ability of a fluorescent probe, rhodamine B isothiocyanate, to interact with nanoparticle surface was used, by the isothiocyanate functionality, to immobilize glucose oxidase (GOx) and bovine serum amino oxidase (BSAO). These enzymes (GOx and BSAO) immobilized on nanoparticle surface retained their catalytic acitvity, although a reduction of catalytic activity was observed. This reduction was attributed to steric effects, i.e., a lower accessibility of the active site for the substrate, conformational changes in the enzyme structure following the immobilization or partial denaturation of the enzyme during the experimental conditions used for the immobilization. The SAMN@GOx complex was used to develop an electrochemical biosensor for glucose determination in food samples (Biosensors and Bioelectronics, 2012). Meanwhile, the SAMN@BSAO adduct was used to produce cytotoxic products, such as hydrogen peroxide, aldehydes and ammonia, in tumor cells (International Journal of Nanomedicine, 2012). The presence of nanocatalyst can be conveniently monitored by its fluorescence and it can be quickly removed by the application an external magnet and re-used several times without loss of the catalytic efficiency.

Con il rapido sviluppo delle nanotecnologie, le nanoparticelle magnetiche sono ad oggi largamente studiate. Da tempo è noto, che le proprietà chimico-fisiche delle nanoparticelle differiscono da quelle del materiale grezzo avente la stessa composizione. In particolare, le caratteristiche che compongono le nanoparticelle sono: elevato rapporto superficie su volume, elevata reattività superficiale, elevata efficienza catalitica e forte capacità di adsorbimento, caratteristiche utili nell’immobilizzare sulla loro superficie determinate molecole. Le nanoparticelle utilizzate in questo progetto di ricerca, chiamate SAMN (surface active maghemite nanoparticles), sono state sintetizzate mediante un semplice ed innovativo metodo di sintesi, in un intervallo di dimensioni attorno ai 10 nm, e sono caratterizzate da un comportamento chimico specifico senza alcuna modificazione o derivatizzazione superficiale. Queste nanoparticelle magnetiche presentano un elevato momento magnetico e proprietà superparamagnetiche, ossia, tali particelle sono in grado di rispondere all’applicazione di un campo magnetico esterno e, una volta rimosso, non trattengono alcuna magnetizzazione residua. Perciò, particelle superparamegnetiche risospese, possono essere rimosse da una sospensione, mediante applicazione di un campo magnetico esterno e, una volta rimosso, non formano aggregati. Un brevetto internazionale, che coinvolge l’Università di Padova, è stato depositato a protezione del metodo di sintesi e di alcune applicazioni. La caratterizzazione del materiale è stata effettuata mediante microscopio a trasmissione elettronica, analisi spettrofotometriche e spettrofluorimetriche, spettroscopia infrarosso e Mossbauer, da misure di magnetizzazione nell’intervallo di temperatura tra 2 K e 300 K e mediante studi di diffrazione a raggi x su polveri (XRPD) (Acta Biomaterialia, 2012), in collaborazione con il Dipartimento di Scienze Chimiche e il Dipartimento di Geoscienze dell’Università di Padova e il Centro di Ricerca per i Nanomateriali dell’Università di Palacky in Olomouc (Repubblica Ceca). La superficie di queste nanoparticelle è stata funzionalizzata con proteine di grande interesse biotecnologico, quali la perossidasi di rafano, l’avidina e la biotina, allo scopo di unire il vantaggio proveniente dall’immobilizzazione delle proteine su nanomateriali e la semplicità d’uso delle nanoparticelle magnetiche. Questo sistema nanostrutturato magnetico composto da nanoparticelle e bioelementi, è stato usato per sviluppare un metodo poco costoso, semplice e rapido per la purificazione di proteine, per l’immobilizzazione di enzimi, per applicazioni in clinica diagnostica e per lo sviluppo di biosensori. In particolare, il complesso SAMN@avidina è stato usato per purificare la proteina umana ricombinante Ca2+ - ATPasica , SERCA-1A, espressa in S. Cerevisiae. La SERCA è una proteina di membrana Ca2+-ATPasica abbondante nel muscolo scheletrico la cui funzione è indispensabile nel sistema di accoppiamento eccitazione-contrazione. Viene usata come prototipo di un’intera famiglia di pompe ATP-asica di tipo P, che oltre ad essere coinvolte nel trasporto dello ione Ca2+, sono coinvolte anche nel sistema di trasporto dei protoni Na+,K+ e H+,K+ e nel trasporto di metalli pesanti. Purificare in maniera efficiente tale proteina, permette di analizzarla mediante cristallografica a raggi x ed elucidare così importanti aspetti dell’attivazione della pompa e la sua regolazione. Inoltre, la capacità della sonda, rodamina B isotiocianato, di interagire con la superficie delle nanoparticelle, tramite il gruppo isotiocianato, è stata sfruttato per immobilizzare la glucosio ossidasi (GOx) e l’ammino ossidasi di siero bovino (BSAO). Questi enzimi (GOx e BSAO) immobilizzati sulla superficie delle nanoparticelle mantengono la loro attività catalitica, sebbene sia stata osservata una riduzione dell’attività catalitica. La riduzione è attribuita ad effetti sterici, ad esempio, alla minor accessibilità del sito attivo al substrato, a cambi conformazionali nella struttura enzimatica in seguito all’immobilizzazione o alla parziale denaturazione dell’enzima nelle condizioni sperimentali usate per la sua immobilizzazione. Il complesso SAMN@GOx è stato usato per sviluppare un biosensore elettrochimico per la determinazione del glucosio in campioni alimentari (Biosensors and Bioelectronics, 2012). Nel frattempo, il complesso SAMN@BSAO è stato usato per produrre prodotti citotossici, quali perossido di ìdrogeno, aldeidi ed ammoniaca, in cellule tumorali (International Journal of Nanomedicine, 2012). La presenza del nanocatalizzatore può essere convenientemente monitorata mediante la sua fluorescenza e può essere rapidamente rimosso tramite applicazione di un campo magnetico esterno e riutilizzato diverse volte senza perdere la sua efficienza catalitica.