Regolazione della tirosin-fosforilazione della proteina Banda 3 Eritrocitaria

In human erythrocytes, Syk kinase is a key enzyme that triggers membrane protein band 3 Tyr-phosphorylation (Tyr-P). This enzyme, also called p72Syk, undergoes significant proteolysis in the absence of protease inhibitors, giving rise to p36Syk formation, which induces much greater band 3 Tyr-P then p72Syk. Besides, proteolysed Syk is capable to prepare membranes for further phosphorylation by p72Syk: when membranes are pre-phosphorylated by p36Syk, subsequent p72Syk-catalysed phosphorylation is much higher than that obtained with non-pretreated membranes. Since proteolytic enzymes are present in isolated membranes and p72Syk binds closely to the cytoskeleton, probably to the spanning domain of the anchored band 3, this binding could allow the activation of the enzyme by proteolysis. In human erythrocytes, the P-Tyr level of proteins, mainly transmembrane band 3, is closely controlled by the antithetic activity of Tyr-protein kinases and phosphatases, resulting in a dephosphorylated state. Only after particular stimuli, as with oxidizing agents, diamide or pervanadate, or thiol alkylating compound, N-ethyl maleimide (NEM), Tyr-phosphorylation of band 3 can be triggered, due to the inhibition of Tyr-phosphatase action and the reorganisation of erythrocyte membrane. SHP-1 is a SH2-domain containing protein Tyr-phosphatase expressed in hematopoietic cell lines. We demonstrate that, in human erythrocytes, SHP-1 is present in membranes from resting cells, but in 5% of the protein amount. This amount increases up to three fold following NEM treatment of intact cells, whereas diamide and pervanadate do not alter the normal protein location. In addition, SHP-1 translocation from cytosol to membrane is not affected by band 3 P-Tyr level and localizes into the cytoskeletal compartment. Band 3 is the target of SHP-1, which dephosphorylates Tyr residues 8, 21 and 904. From the cytosol of the red blood cells, through a DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography followed by a Sephadex G-75 column, we purified an enzyme with phosphatasic activity on pNPP. Its characterization revealed that the enzyme is an acid phosphatase with a low molecular weight, and western blotting followed by immunostaining with the appropriate antibody confirmed that the enzyme was the Low Mr PTPase. The purified enzyme was able to dephosphorylate the four Tyr residues of band 3: 8, 21, 359 and 904, thus inducing for the first time the total dephosphorylaion of this protein. Dapsone is a drug used in the treatment of leprosy, malaria or AIDS-related Pneumocystis pneumonia. N-hydroxylation of dapsone (DDS) leads to the formation of the toxic hydroxylamines responsible for the clinical methaemoglobinaemia associated with DDS therapy. In addition, the drug has been associated with shortening of the erythrocyte lifespan, with resulting potential clinical consequences such as anaemia and morbidity in areas where DDS is used to treat malaria. We studied how DDS and/or its hydroxylamine (DDS-NHOH) induce erythrocyte membrane alterations leading to premature cell removal. Results indicate that the hydroxylamine, but not dapsone, is able to trigger Tyr-phosphorylation of membrane proteins, mainly of band 3. DDS-NHOH-induced band 3 Tyr-P peaked in 30’ (at 0.3 mM) and was already completely reversed after 45’ of incubation. However, when analysed for the enzymes involved in this process, Syk and SHP-2, membranes revealed dose- and time-dependent recruitment of both enzymes. Band 3 Tyr-phosphorylation is not due to an imbalance between enzymatic activities, since both Tyr-kinase and phosphatase activities were promptly inhibited by DDS-NHOH in both dose- and time-dependent manners, but more probably by a favoured substrate-kinase interaction. The band 3 Tyr-phosphorylation process is very useful in detecting early DDS-NHOH-induced alterations. The membrane modifications continue, with the increase in DDS-NHOH incubation time, leading to aggregation of band 3. Band 3 high molecular weight aggregates (HMWA) location in the first 30’ of incubation was in the Triton-soluble fraction of the RBCs’membranes, while prolonging the incubation time, not only the content of band 3 HMWA further increased, but complete membrane reorganisation also occurred, the cytoskeleton containing almost all the band 3 HMWA complexes formed. When we analysed membranes from erythrocytes subjected to dose- and time-dependent DDS-NHOH treatments in the presence of autologous plasma, immunostaining with anti-human IgG revealed net enhancement of the autologous antibodies content. Since removal of human erythrocytes is mediated by antibody recognition, this can explain the shortening of the erythrocyte lifespan seen when dapsone is used clinically.

Negli eritrociti umani la tirosin chinasi Syk è un enzima chiave nella tirosin fosforilazione della proteina di membrana banda 3. Questo enzima, chiamato anche p72Syk, va incontro ad una significante proteolisi in assenza di inibitori proteasici, portando alla formazione di p36Syk, capace di indurre con maggiore efficienza la tirosin fosforilazione della banda 3 rispetto al p72Syk. Inoltre, la fosforilazione innescata dal p36Syk prepara le membrane per la successiva fosforilazione da parte dell’oloenzima p72Syk. Infatti quando le membrane sono pre-fosforilate con p36Syk, la successiva fosforilazione catalizzata dal p72Syk è maggiore rispetto a quella ottenuta in assenza della pre-fosforilazione. Poiché gli enzimi proteolitici sono presenti nelle membrane isolate e il p72Syk si lega al citoscheletro della cellula, probabilmente al dominio transmembrana della banda 3 ancorata a questa frazione della membrana, questo legame potrebbe permettere l’attivazione dell’enzima p72Syk attraverso la sua proteolisi. Negli eritrociti umani il livello di tirosin fosforilazione delle proteine, soprattutto della proteina transmembrana banda 3, è strettamente controllato dall’attività antitetica delle protein tirosin chinasi e fosfatasi, risultando in condizioni basali in uno stato di quasi completa defosforilazione. Solo stimoli particolari, come agenti ossidanti, diamide o pervanadato, o composti alchilanti, N-etilen maleimide (NEM), possono innescare la tirosin fosforilazione della banda 3, dovuta l’inibizione delle tirosin fosfatasi. SHP-1 è una protein tirosin fosfatasi contenente due domini SH2 espressa nelle cellule ematopoietiche. Noi dimostriamo che, negli eritrociti umani, SHP-1 è presente nelle membrane delle cellule in condizioni basali, ma solo il 5% della quantità totale dell’enzima. Questa percentuale incrementa fino a tre volte dopo il trattamento della cellula con NEM, mentre diamide e pervanadato, pur inducendo la tirosin fosforilazione della banda 3, non alterano la localizzazione basale dell’enzima. Ciò indica che la traslocazione della SHP-1 dal citoplasma alle membrane non dipende dalla tirosin fosforilazione della banda 3. Abbiamo dimostrato che la banda 3 è un substrato per l’enzima e che esso defosforila i residui tirosinici 8, 21 e 904 della proteina. Dal citoplasma del globulo rosso abbiamo purificato un’enzima con attività fosfatasica su para-nitro fenilfosfato (pNPP) attraverso una cromatografia a scambio ionico su DEAE-Sepharose, seguita da una gel filtrazione su una colonna G-75 Sephadex. La caratterizzazione dell’enzima purificato ha portato alla sua identificazione con la fosfatasi acida a basso peso molecolare. Tale identificazione è stata confermata dal western blotting, seguito dalla immunorivelazione con l’anticorpo appropriato. La fosfatasi acida a basso peso molecolare purificata è in grado di defosforilare i quattro siti fosfo tirosinici della banda 3: 8, 21, 359 e 904. In questo modo si è ottenuta per la prima volta la totale defosforilazione della proteina. Dapsone è un farmaco utilizzato nel trattamento della lebbra, malaria o pneumonia dovuta a Pneumocystis associata all’ AIDS. La sua N-idrossilazione porta alla formazione di idrossilamine tossiche responsabili della metaemoglobinemia associata al trattamento con dapsone. Inoltre, il farmaco è stato correlato alla riduzione della vita media dell’eritrocita, ottenendo come risultato conseguenze cliniche come anemia e morbidità nelle aree dove il dapsone è utilizzato per trattare la malaria. Noi abbiamo studiato il processo attraverso il quale il dapsone ed il suo metabolita idrossilamindapsome (DDS-NHOH) inducono alterazioni a livello della membrana eritrocitaria che portano alla rimozione prematura dell’eritrocita. I risultati indicano che DDS-NHOH, ma non il dapsone, è capace di innescare la tirosin fosforilazione delle proteine di membrana, soprattutto della banda 3. L’indotta tirosin fosforilazione raggiunge un massimo in 30’ di trattamento (con 0.3 mM) poi essa comincia a calare e dopo 45’ dall’inizio del processo sparisce completamente. Il reclutamento alla membrana degli enzimi coinvolti in questo processo, Syk e SHP-2, avviene in maniera dose e tempo dipendente, per entrambi gli enzimi. Inoltre la tirosin fosforilazione della banda 3 non è dovuta ad uno sbilanciamento tra le attività enzimatiche, dal momento che sia l’attività tirosin chinasica che quella tirosin fosfatasica sono inibite dal DDS-NHOH in maniera dose e tempo dipendente, ma più probabilmente è dovuta ad una favorevole interazione substrato-chinasi. Le modifiche che avvengono nella membrana indotte da DDS-NHOH continuano anche dopo che la la fosforilazione è annulata (dopo 45’) e portano all’aggregazione della banda 3. La localizzazione degli aggregati ad alto peso molecolare di banda 3 (HMWA) nei primi 30’ di incubazione è prevalentemente nella frazione solubile in Triton X-100. Con il prolungamento del tempo d’incubazione si ha non solo l’ulteriore incremento della quantità di aggregati, ma anche un loro definitivo spostamento nel citoscheletro della membrana eritrocitaria. Questo è un indizio di una completa riorganizzazione della membrana. L’analisi delle membrane ottenute da eritrociti incubati con concentrazioni crescenti di DDS-NHOH a vari tempi d’incubazione in presenza del plasma autologo ha rivelato un netto aumento nel contenuto di anticorpi autologhi. Poiché la rimozione dell’eritrocita è mediata dal riconoscimento da parte dei macrofagi degli anticorpi autologhi, la presenza di quest’ultimi sulla membrana del globulo rosso trattato con DDS-NHOH spiega la riduzione della vita media degli eritrociti nei pazienti trattati con dapsone.