Confined extracellular environment affects pluripotency maintenance and acquisition

Human pluripotent stem cells represents an unlimited source of desired cells and a powerful model for early embryogenesis. In vitro, two stages of pluripotent stem cells (naïve and primed) have been isolated. Moreover, in vitro, pluripotency can be re-acquired by somatic cells thanks to cell reprogramming, which rewrites cell expression program, opening doors for patient-specific personalized medicine. The use of microfluidic platforms for cell reprogramming allows cost-effective and boosts high-efficiency experiments, but the reasons behind this increase in efficiency have not been uncovered yet. Cancer can be considered a pathological alteration of cell expression program where abnormal gene mutations allow the de-differentiation of somatic cells and the re-acquisition of stem-like features such as proliferation and motility. Cell reprogramming could act as a tool to reset cancerous epigenetic state and re-establish the correct expression program. Current studies focus mainly on gene expression differences between naïve and primed stem cells or between somatic and pluripotent cells, without considering the extracellular environment surrounding those cells, the extracellular matrix contribution and the spatial organization of these cells in the 3D space. Nevertheless, those factors have been proved to be fundamental for embryo development. Aiming at analyzing confined environment contribution to pluripotency maintenance and acquisition, in vitro cell culture environment has been miniaturized in microfluidic platforms to mimic in vivo conditions. Molecular target-driven approaches have been coupled with multi-omic approaches such as secretome and trascriptome analysis, moreover, single-cell approaches have been applied to dissect cell heterogeneity. Initially the colony structure and extracellular matrix organization in naïve and primed pluripotent stem cells, as well as in differentiated fibroblasts has been analyzed in conventional cell culture devices, reporting a striking difference in matrix organization among the different stages. Then the influence of confined environment on the above-mentioned stages has been investigated, revealing the role of confined environment in inducing matrix production. Afterward, the link between colony shape, mechanotransduction and matrix deposition has been examined for the first time in naïve pluripotent stem cells, revealing that 3D spatial organization is linked to higher extracellular matrix deposition and naïve pluripotency marker expression. Next, extracellular matrix organization after cell reprogramming has been analyzed in newborn pluripotent colonies, both in conventional devices and in confined environment, showing a different organization of matrix deposition in the two conditions that can contribute to explain the high reprogramming efficiency obtained in microfluidic platforms. Aiming at simulating cancer reprogramming of tumors overexpressing the serine-protease inhibitor SERPINB3 and studying possible SERPINB3 influences on cancer reprogramming, this serpin has been administered during cell reprogramming of a model cell line, resulting in drastic reduction of reprogramming efficiency. The possible reasons for this outcome have been investigated also thanks to transcriptomic database analysis of SERPINB3-related gene network. In conclusion, this work contributes to pluripotent stem cells knowledge by giving for the first time a portrait of extracellular matrix organization in naïve and primed pluripotent stem cells. Moreover, it shows how extracellular matrix and 3D colony organization is linked to pluripotency gene expression in naïve pluripotent stem cells, and to pluripotency acquisition via cell reprogramming. Finally, it reports how SERPINB3, a protein that is highly expressed in aggressive tumors, inhibits cell reprogramming, suggesting an inhibition of this protein if approaching reprogramming of tumors with high SERPINB3 expression.

Le cellule staminali pluripotenti umane sono sia una fonte illimitata di cellule d’interesse, sia un modello di embriogenesi. In vitro sono stati isolati due stadi di cellule staminali pluripotenti: naïve e primed. Inoltre, la pluripotenza può anche essere riacquisita da cellule differenziate, grazie alla riprogrammazione cellulare che riscrive il programma di espressione cellulare aprendo le porte alla medicina personalizzata. L’utilizzo di chip microfluidici per la riprogrammazione cellulare consente esperimenti ad alta efficienza e costi ridotti. Le ragioni per questa alta efficienza di riprogrammazione non sono pienamente noti. Il cancro può essere considerata un’alterazione patologica del programma di espressione cellulare, dove mutazioni geniche promuovono un de-differenziamento delle cellule con riacquisizione di proliferazione illimitata e motilità. La riprogrammazione cellulare può resettare lo stato epigenetico tumorale e ristabilire il corretto programma di espressione. I recenti studi si focalizzano principalmente sulle differenze di espressione genica fra cellule staminali naïve, primed, somatiche o riprogrammate, senza considerare l’ambiente extracellulare che circonda le cellule stesse, il contributo della matrice extracellulare e l’organizzazione spaziale tridimensionale di queste cellule; fattori fondamentali per lo sviluppo embrionale in vivo. Allo scopo di analizzare il contributo dell’ambiente confinato al mantenimento e all’acquisizione di pluripotenza, l’ambiente di coltura è stato miniaturizzato con chip microfluidici per simulare le condizioni in vivo. Bersagli molecolari specifici sono stati affiancati da approcci multi-omici come l’analisi del secretoma e del trascrittoma. Inoltre, l’eterogeneità del sistema è stata analizzata con tecniche single-cell. La struttura della matrice extracellulare di cellule staminali naïve e primed e di fibroblasti differenziati cresciuti in supporti convenzionali di crescita cellulare è stata analizzata, dimostrando una differente organizzazione della matrice extracellulare. In seguito è stata valutata l’influenza dell’ambiente confinato in piattaforme microfluidiche, rivelandone un ruolo nell’indurre produzione di matrice. Successivamente è stato esaminata in colonie naïve, la relazione tra forma 3D della colonia, meccanotrasduzione e deposizione di matrice, rivelando che a una maggior organizzazione 3D della colonia corrisponde a maggior produzione di matrice e di espressione di marcatori di pluripotenza naïve. Inoltre l’organizzazione della matrice extracellulare è stata analizzata alla fine del processo di riprogrammazione cellulare sia in supporti convenzionali sia in piattaforme microfluidiche, mostrando una deposizione molto dissimile nei due ambienti. Questa osservazione può contribuire a spiegare l’alta efficienza di riprogrammazione ottenuta in piattaforme microfluidiche. Per simulare la riprogrammazione di cellule tumorali con elevata espressione di SERPINB3 e studiare la possibile influenza di SERPINB3 su tale processo, la proteina è stata somministrata durante esperimenti di riprogrammazione di cellule modello, portando al crollo dell’efficienza di riprogrammazione. Per spiegare il risultato sono stati analizzati geni collegati a SERPINB3 in database trascrittomici. Questa tesi contribuisce ad accrescere le conoscenze sulle cellule staminali pluripotenti analizzando per la prima volta l’organizzazione della matrice extracellulare in cellule staminali pluripotenti naïve e primed. Inoltre mostra come la matrice extracellulare e l’organizzazione tridimensionale della colonia siano collegati all’espressione di geni di pluripotenza in cellule naïve e all’acquisizione di pluripotenza in caso di riprogrammazione cellulare. Infine riporta come SERPINB3 inibisce la riprogrammazione cellulare, suggerendo la possibilità di inibire questa serpina per affrontare la riprogrammazione di tumori con elevata espressione di SERPINB3.