Molecular and functional characterization of 2mit, an intronic gene of Drosophila melanogaster timeless2 locus

Drosophila melanogaster 2mit is a nested gene of timeless2 (tim2), a locus which controls both chromosome stability and circadian photoreception. 2mit is localized in tim2 intron 11 and is transcribed in opposite direction with respect to its host gene. In silico analyses suggest that it codes for a putative 1141 aa transmembrane protein characterized by a conserved extracellular leucine-rich repeat (LRR) domain, known to be important for protein-protein interactions. 2mit mRNA is expressed from early embryonic stages, prevalently in the developing central nervous system. In adult brains, 2mit mRNA is mainly localized in mushroom bodies and ellipsoid-body, structures involved in the control of locomotor activity and memory, and at minor level in optic lobes. The aim of this project is to determine 2mit role in Drosophila nervous system, mainly focusing on the adult stage, paying also attention on a possible 2mit functional correlation with tim2. 2mit mRNA levels have been determined in six independent strains, each carrying a transposon insertion in proximity or within 2mit locus. Only one strain, PB2mitc03963, showed a significant 2mit mRNA decrement compared to the wild-type (~50% in larvae, ~85% in adult heads). This PB2mitc03963 strain and lines presenting double strand RNA interference-mediated 2mit knock down (KD), either pan-neuronal or in specific brain tissues, were used for 2mit functional characterization. Given 2mit mRNA expression in optic lobes of wild-type brains, we evaluated visual system integrity in 2mit- lines at both larval and adult stage. We found that PB2mitc03963 mutants displayed defects in optic-motor coordination at adult stage. Since tim2 is involved in circadian photoreception, we investigated a possible 2mit role in the circadian system. PB2mitc03963 flies displayed a circadian photoreception similar to that of wild-type, suggesting that 2mit has a different role with respect to tim2. However, both PB2mitc03963 strain and lines with pan-neuronal 2mit KD exhibited a slight but significant lengthening of circadian periodicity in constant conditions. Moreover, PB2mitc03963 mutants showed a mild modification in the 24 h kinetics of the clock protein PERIOD in brain neurons important for the control of circadian periodicity. As 2mit expression pattern in wild-type brains includes mushroom bodies and ellipsoid-body, we analysed general locomotor activity parameters (such as distance moved and immobility time) at both larval and adult stage, but no significant effects were detected in 2mit- flies. In addition, we tested PB2mitc03963 flies short-term associative memory phenotype, obtaining that PB2mitc03963 mutants showed memory impairments compared to controls. In order to confirm 2mit involvement in visual response, memory and circadian periodicity, we produced and tested several transgenic lines carrying a construct for 2mit overexpression, in PB2mitc03963 mutant background. Rescue experiments confirmed a 2mit role in motion vision and in short-term associative memory, but not its putative function in the control of free running periodicity. To better understand 2MIT molecular functions, we searched for 2MIT possible interactors screening a Drosophila cDNA library in yeast two-hybrid system. As possible candidate we found NCKX30C, a transmembrane protein involved in signaling events, expressed both during development and in adult nervous system. Taken together, the achieved results suggest that 2MIT protein might represent a brain membrane receptor with different roles in signaling circuits of Drosophila adult brain.

Drosophila melanogaster 2mit è un gene intronico di timeless2 (tim2), un locus genico coinvolto sia nella stabilità cromosomica che nella fotorecezione circadiana (Benna et al., 2010). 2mit è localizzato nell’undicesimo introne di tim2 ed è trascritto nella direzione opposta rispetto al suo gene ospite. Analisi in silico suggeriscono che 2mit codifica per una proteina transmembrana putativa di 1141 aa, che presenta, nella sua porzione extracellulare, un dominio conservato formato da ripetizioni ricche in leucine (leucine-rich repeats; LRR), importante per interazioni proteina-proteina. L’mRNA di 2mit è espresso fin dallo stadio embrionale, prevalentemente nel sistema nervoso in via di sviluppo. In cervelli allo stadio adulto, l’mRNA di 2mit è principalmente localizzato a livello dei corpi fungiformi e del corpo ellissoidale, strutture coinvolte nel controllo dell’attività locomotoria e della memoria, ed una debole espressione è rilevata anche in corrispondenza del lobo ottico. Lo scopo di questo progetto è determinare il ruolo di 2mit nel sistema nervoso di Drosophila, con particolare attenzione allo stadio adulto, con l’intenzione anche di valutare se 2mit presenta una possibile correlazione funzionale con il suo gene ospite tim2. I livelli di espressione dell’mRNA di 2mit sono stati determinati in sei ceppi indipendenti, ognuno dei quali caratterizzato dall’avere un transposone inserito in prossimità o all’interno del locus di 2mit. Solo uno di questi ceppi, PB2mitc03963, ha mostrato una significativa riduzione dei livelli di mRNA di 2mit rispetto a quelli del controllo (50% nelle larve, ~85% nelle teste di adulto). Il ceppo PB2mitc03963 e linee caratterizzate dall’avere un knock-down (KD) di 2mit, sia a livello pan-neuronale che in specifiche regioni del cervello, dovuto all’attivazione del meccanismo dell’RNA interference, sono state utilizzate per la caratterizzazione funzionale di 2mit. Data l’espressione dell’mRNA di 2mit nei lobi ottici di cervelli wild-type, abbiamo valutato l’integrità del sistema visivo nelle diverse linee 2mit-, sia allo stadio larvale che adulto. Abbiamo trovato che mutanti PB2mitc03963 hanno esibito difetti nella coordinazione ottico-motoria allo stadio adulto. Poiché tim2 è coinvolto nella fotorecezione circadiana, abbiamo investigato un possibile ruolo di 2mit nel sistema circadiano. Individui PB2mitc03963 hanno mostrato un comportamento legato alla fotorecezione circadiana simile a quello dei controlli, indicando che 2mit ha un ruolo diverso rispetto a tim2. Comunque, sia il ceppo PB2mitc03963 che le linee con KD di 2mit guidato in tutto il sistema nervoso hanno esibito un leggero ma significativo allungamento della periodicità circadiana in condizioni costanti. Inoltre, mutanti PB2mitc03963 hanno presentato una leggera alterazione nella cinetica di accumulo nucleare durante le 24 ore della proteina orologio PERIOD in neuroni del cervello importanti per il controllo della periodicità circadiana. Poiché l’espressione di 2mit in cervelli wild-type comprende i corpi fungiformi ed il corpo ellissoidale, abbiamo analizzato parametri dell’attività locomotoria generale (come la distanza percorsa e il tempo di immobilità) in mutanti 2mit-, sia allo stadio larvale che adulto, ma non sono stati rilevati effetti significativi. In aggiunta, abbiamo testato il fenotipo della memoria associativa a breve termine in individui PB2mitc03963, ottenendo che i mutanti hanno mostrato un danneggiamento associato alla memoria in confronto ai controlli. Per confermare il coinvolgimento di 2mit nella risposta visiva, nella memoria e nella periodicità circadiana, abbiamo prodotto e testato diverse linee transgeniche contenenti un costrutto per la sovraespressione di 2mit nel background genetico mutante PB2mitc03963. Esperimenti di rescue del fenotipo hanno confermato un ruolo di 2mit nella percezione visiva del movimento e nella memoria associativa a breve termine, ma non hanno confermato il suo coinvolgimento nella modulazione della ritmicità circadiana in condizioni costanti. Per meglio comprendere le funzioni molecolari di 2MIT, abbiamo cercato dei suoi possibili interattori attraverso lo screening di una libreria di cDNA di Drosophila nel sistema del doppio ibrido di lievito. Come possibile candidato abbiamo individuato NCKX30C, una proteina transmembrana coinvolta in eventi di signaling ad espressa sia durante lo sviluppo che nel sistema nervoso adulto. In conclusione, considerati nell’insieme, i risultati ottenuti indicano che la proteina 2MIT potrebbe rappresentare un recettore di membrana con diversi ruoli nei circuiti cerebrali nel cervello adulto di Drosophila.