Photoprotective mechanisms in chlorophyll-binding proteins studied by means of electron paramagnetic spectroscopies

Light is essential for photosynthesis, and hence in supporting life on earth, but all the steps of the light reactions may lead to the formation of dangerous oxidative species. Chlorophyll a, the green heart of oxygenic photosynthesis, is also its main Achilles' heel, due to a high intersystem crossing (ISC) probability that leads to the production of excited triplet state, an efficient singlet oxygen sensitizer. Photosynthetic organisms have consequently developed several photoprotective mechanisms aimed to avoid photo-oxidative stress originated from the excess of absorbed light, that otherwise would ultimately lead to cell death. Photoprotection is pivotal for life on Earth, however a full comprehension of the molecular mechanisms is still lacking for several of the processes that photosynthetic organisms employ. The knowledge of the diverse adaptations of the photoprotective response to the various natural conditions in which photosynthetic organisms have evolved promises to highlight the essential characteristics that an efficient mechanism has to display. This understanding of the key molecular requirements for an efficient photoprotection may be exploited for the design of bio-mimetic molecular systems in the fields of artificial photosynthesis, photodynamic therapies and photocatalysis, to make them more durable in virtue of specifically tailored photoprotective mechanisms. The quickest of the photoprotective processes taking place in natural photosystems relies on the capability of carotenoids to photoprotect the system, either by directly quenching the triplet state of chlorophyll through triplet-triplet energy transfer, or by deactivation of the photosensitized singlet oxygen once it is formed. With the aim of studying this pivotal trait of photosynthetic organisms, in the course of my graduate research I characterized the role of carotenoids in the photoprotection of the two major components of the oxygenic photosynthetic machinery, namely Photosystem I and Photosystem II. Due to the high complexity of the studied samples, consisting of multi-subunit complexes formed by the assembly of Reaction Centers with numerous bound antenna complexes, an Optically Detected Magnetic Resonance (ODMR) approach has been utilized. ODMR, being a double resonance technique, makes possible to disentangle the different triplet state contributions and extract the information regarding the triplet states populated upon illumination in the multi-chromophore complex of interest. A comparative approach, involving either differences in the size of the complexes or mutations, allowed to get insight into the energy transfer pathways and into the differential role that β-carotene and xanthophylls play in the photoprotection of the two photosystems. With the aim to extend the study of natural photoprotective mechanisms and understand them at a molecular level, we started to work on an unusual chlorophyll binding protein, the Water-Soluble Chlorophyll-binding Protein (WSCP). This research has been conduct in the framework of a joint project between the university of Padova and the university of Mainz. WSCP remarkably differs from the other known chlorophyll-binding proteins, being not involved in the photosynthetic process. WSCP has been shown to be an incredibly stable complex, being able to protect its chlorophylls towards photodamage. Interestingly this protein does not contain carotenoids, in contrast to every other known chlorophyll-binding protein. By combining biochemical and spectroscopic methodologies, we discovered a mechanism for the photoprotection of chlorophylls in WSCP completely new in the landscape of photoprotection We demonstrated that the observed resistance of the WSCP-bound chlorophylls to singlet oxygen damage depends on the localization of the phytyls moieties between the chlorophylls forming a tight dimer in WSCP. We were able to propose a photoprotective mechanism based on the capability of the phytyls to limit the singlet oxygen accessibility to the oxidizable sites of the chlorophylls.

La luce è essenziale nel sostenere il processo fotosintetico, e con esso la vita sulla terra, ma la fase luminosa della fotosintesi è anche piagata dalla formazione di pericolose specie ossidanti. La clorofilla a, molecola su cui si basa la fotosintesi ossigenica, ne è anche il principale tallone d’Achille, a causa della sua elevate probabilità di intersystem crossing (ISC) con la conseguente alta resa di tripletto, uno stato elettronico che può efficacemente foto-sensibilizzare l’ossigeno allo stato di singoletto. Gli organismi fotosintetici di conseguenza hanno sviluppato svariati meccanismi fotoprotettivi finalizzati a ridurre lo stress ossidativo causato dall’eccessivo assorbimento luminoso, che altrimenti ne causerebbe la morte. La fotoprotezione è essenziale per la vita sulla terra, ma è ancora incompleta la comprensione ad un livello molecolare per molti dei processi fotoprotettivi impiegati dagli organismi fotosintetici. La conoscenza dei diversi adattamenti della risposta foto-protettiva alle diverse condizioni ambientali nelle quali gli organismi fotosintetici si sono evoluti dovrebbe permettere di evidenziare le caratteristiche essenziali che un efficiente meccanismo foto-protettivo deve possedere. Questa comprensione delle caratteristiche molecolari necessarie per un’efficiente foto-protezione promette di essere sfruttabile nella progettazione di sistemi molecolari bio-mimetici nei campi della fotosintesi artificiale, della terapia fotodinamica e della fotocatalisi, di modo da rendere le molecole foto-attive più stabili in virtù di meccanismi fotoprotettivi specificatamene progettati. I più rapidi di questi processi fotoprotettivi nei sistemi fotosintetici naturali sfruttano i carotenoidi per foto-proteggere il sistema, sia tramite una diretta diseccitazione dello stato di tripletto della clorofilla tramite un trasferimento di energia tripletto-tripletto, che tramite una diretta diseccitazione dell’ossigeno di singoletto foto-prodotto. Con l’intento di studiare questi importanti processi fotoprotettivi, nel corso del mio dottorato abbiamo studiato il ruolo fotoprotettivo dei carotenoidi nei due principali macchinari fotosintetici, ovvero il Fotosistema I e il Fotosistema II. A causa della loro elevata complessità, essendo complessi multimerici formati dall’assemblaggio dei centri di reazione con numerose antenne, nella loro caratterizzazione abbiamo impiegato la Risonanza Magnetica Rilevata Otticamente (ODMR). Questa metodologia, essendo una tecnica di doppia risonanza, rende possibile lavorare su complessi sistemi multicromoforici permettendo di isolare i contributi dei singoli stati di tripletto presenti nei campioni d’interesse. Un approccio comparativo, basato in un caso sulla differente dimensione dei complessi e nell’altro su opportune mutazioni di enzimi coinvolti nella funzionalizzazione dei carotenoidi, ha permesso di ottenere nuove informazioni riguardanti i cammini di trasferimento energetico e i differenti ruoli che il β-carotene e le xantofille svolgono nella fotoprotezione dei due fotosistemi. Per accrescere la varietà di meccanismi fotoprotettivi caratterizzati con un livello di dettaglio molecolare, abbiamo iniziato a studiare un’inusuale proteina che lega la clorofilla, la Water-Soluble Chlorophyll-binding Protein (WSCP). Questo filone di ricerca è stato condotto nel contesto di un progetto congiunto tra le università di Padova e di Mainz. WSCP differisce significativamente dalle altre proteine che legano la clorofilla non essendo coinvolta nel processo fotosintetico. Questa proteina si è dimostrata essere un complesso incredibilmente stabile, capace di foto-proteggere efficacemente le clorofille che lega. Sorprendentemente questa foto-stabilità è raggiunta senza l’impiego di carotenoidi, contrariamente ad ogni altra proteina contente clorofilla nota. Combinando metodologie di indagine biochimiche e spettroscopiche, abbiamo caratterizzato in WSCP un nuovo meccanismo di fotoprotezione delle clorofille. Abbiamo infatti dimostrato che la resistenza delle clorofille legate da WSCP al danneggiamento foto-indotto dipende dalla localizzazione delle catene fittoliche tra le clorofille che formano un dimero in WSCP. Abbiamo quindi proposto un meccanismo foto-protettivo basato sulla capacità dei fittoli di limitare l’accesso dell’ossigeno di singoletto ai siti ossidabili delle clorofille.