Regulation of the Mitochondrial Permeability Transition Pore by Arginine Residue(s) and their Role in the Dimerization of F-ATP Synthase

The mitochondrial permeability transition (PT) is a Ca2+-dependent permeability increase of the inner membrane, mediated by the permeability transition pore (PTP). Depending on open time and channel size, the PTP can participate in Ca2+ homeostasis or cell death. In the 1990s, through the use of modifiers of SH groups and of relatively specific histidine and arginine reagents, a few discrete regulatory sites of the PTP have been defined. Recent evidence suggests that PTP forms from F-ATP synthase. The first part of my work was focused on the identification of the arginine residue(s) conferring PTP regulation by glyoxals within the general hypothesis that the PTP originates from F-ATP synthase. Eriksson and co-workers discovered the PTP-modulatory effects of arginine-selective reagents, and focused on the structure-function relationship of arginine-glyoxal adducts in the regulation of PTP opening and closure in rat liver mitochondria. Phenylglyoxal (PGO) is the most extensively used arginine-specific reagent. I have observed for the first time that PGO affects the PT in a species-specific manner (inhibition in mouse and yeast, induction in human and Drosophila mitochondria), indicating that the ability to modulate the PTP by PGO has been conserved but differs across species. I have been able to show that the effect of PGO on the PT is specifically mediated by Arg 107 of subunit g, the only arginine residue of this subunit that has been conserved across species. Yeast mitochondria lacking subunit g or bearing a subunit g R107A mutation were totally resistant to PT inhibition by PGO. Taking advantage of the species-specific differences but conserved reactivity with PGO, I have observed that substitution of yeast subunit g with its human counterpart confers the “human” phenotype to yeast, suggesting that the species-specific effect of PGO is more likely to depend on structural differences between the yeast and human F-ATP synthase than on the R107-PGO adduct as such. This finding is a step forward in the molecular understanding of PTP regulation, and further supports the hypothesis that the PTP forms from F-ATP synthase. The second part of my work was dedicated to reinvestigate the role of Ca2+ as a permissive factor for PTP opening. The most recent hypothesis about the mechanism of PTP formation is that interaction of Ca2+ with the metal binding site of β subunit (which usually contributes to coordinate the binding of Mg-ATP) causes a conformational change that is propagated to the inner membrane through the lateral stalk, which eventually leads to PTP formation. Yet a PT occurred in the absence of added Ca2+ with several inducers including p-hydroxyphenylgloxal (OH-PGO), one of the arginine reagents that favors PTP opening in rat liver mitochondria; and phenylarsine oxide (PhAsO), a dithiol cross-linker that is a potent PTP inducer. I have observed that pore opening can occur in presence of EGTA after the treatment of mitochondria with OH-PGO and PhAsO, but also that the inducing effect is prevented by depletion of matrix Ca2+ with the ionophore A23187 or by chelation of matrix Ca2+ with BAPTA. These observations indicate that in the absence of matrix Ca2+ PTP cannot be activated by OH-PGO and PhAsO. Another part of my work was to test whether charged amino acids of yeast subunits e and g are involved in their interaction, thus playing a role in the dimerization of F-ATP synthase. I have identified Arg 8 of subunit e as a critical residue in mediating e-g interactions, most likely through an electrostatic bond with Glu 83 of subunit g. We have also observed that dimers purified after blue-native electrophoresis from mutants of Arg 8 show decreased PTP channel conductance and activity, indicating that this residue might directly participate in generating the full conductance channel.

La transizione di permeabilità mitocondriale (PT) è un aumento Ca2+-dipendente della permeabilità della membrana interna, mediato dal poro di transizione della permeabilità (PTP). A seconda della durata delle aperture e della dimensione del canale, il PTP può partecipare all'omeostasi del Ca2+ o alla morte cellulare. Negli anni '90, attraverso l'uso di modificatori di gruppi SH e di reagenti relativamente specifici di istidina e arginina, sono stati definiti alcuni siti regolatori del PTP. Prove recenti suggeriscono che PTP si forma dalla F-ATP sintasi. La prima parte del mio lavoro è stata dedicata all'identificazione dei residui di arginina che conferiscono la sensibilità del PTP ai gliossali, assumendo che il PTP si formi dalla F-ATP sintasi. Il fenilgliossale (PGO) è il reagente specifico per le arginine più comunemente usato. Ho osservato per la prima volta che il PGO influenza il PTP in modo specie-specifico (causando inibizione in topo e nel lievito, mentre induzione in drosofila e nell’uomo), indicando che, nonostante la sua capacità modulatoria sia diversa tra i vari organismi, la sua reattività è invece conservata. Ho potuto dimostrare che l’effetto del PGO è mediato in modo specifico dalla Arg 107 della subunità g della F-ATP sintasi, peraltro conservata tra le specie. I mitocondri di lievito privi di subunità g o esprimenti una subunità g con la mutazione R107A sono totalmente resistenti all'inibizione del PT da PGO. Questa scoperta è un passo avanti nella comprensione molecolare della regolazione PTP, e supporta ulteriormente l'ipotesi che il PTP si generi dalla F-ATP sintasi. La seconda parte del mio lavoro è stata dedicata a reinvestigare il ruolo del Ca2+ come fattore permissivo per l'apertura del PTP. L'ipotesi più recente sul meccanismo di formazione del PTP è che il legame del Ca2+ al sito di legame del metallo della subunità β (che contribuisce a coordinare il legame di Mg-ATP) causa un cambiamento conformazionale che viene propagato alle subunità inserite nella membrana interna attraverso il gambo laterale, portando all‘apertura del PTP. Eppure la PT si verifica ugualmente in assenza di Ca2+ aggiunto utilizzando diversi induttori compreso il p-idrossifenilgliossale (OH-PGO), uno dei reagenti di arginina che favorisce l'apertura del PTP nei mitocondri del fegato di ratto; e la fenilarsina ossido (PhAsO), un reagente dei ditioli e potente induttore del PTP. Tuttavia, nei miei studi ho osservato che l'apertura del PTP può sì verificarsi in presenza di EGTA dopo il trattamento dei mitocondri con OH-PGO e PhAsO, ma l'effetto di induzione temina con l'esaurimento del Ca2+ di matrice causato dallo ionoforo A23187 o con la chelazione del catione con BAPTA. Queste osservazioni indicano che in assenza del Ca2+ di matrice il PTP non può essere attivato da altri modulatori, confermando il ruolo permissivo e strettamente necessario del catione. Un'altra parte del mio lavoro è stata testare se amminoacidi carichi delle subunità di lievito e e g sono coinvolti nella loro reciproca interazione , svolgendo quindi un ruolo chiave nella dimerizzazione della F-ATP sintasi. Grazie ad una mutagenesi sito specifica, ho identificato la Arg 8 della subunità e come residuo critico per tale interazione, agendo molto probabilmente attraverso legami elettrostatici con la Glu 83 della subunità g. Abbiamo anche osservato che i dimeri purificati da BN gels da mutanti privi dell'Arg 8 mostrano una diminuzione della conduttanza e dell'attività di canale del PTP, indicando che questo residuo potrebbe partecipare direttamente alla generazione di un canale correttamente assemblato.