The role of immune surveillance mechanisms acting to prevent an AOM - induced colorectal carcinogenesis progression.

Colorectal cancer (CRC) is one of the most frequent cancer worldwide both in men and women. This tumour is the result of a multistep process in which there is a closed connection between the tumour development and immune system is the so-called immune surveillance, a dynamic process that comprises three different steps: elimination, equilibrium and escape. The hypothesis of my PhD project was that CD80 expression on dysplastic epithelial cells is crucial also in successful immune surveillance of sporadic colorectal cancer. The analysis of human colonic surgical specimens demonstrated that CD80 is over-expressed by epithelial cells in colonic pre-neoplastic lesions. Accordingly, also in our azoxymethane (AOM) induced colonic adenocarcinoma model, CD80 is overexpressed by dysplastic epithelial cells supporting a key role of this molecule in the early phases of the carcinogenesis process. Furthermore, the lack of functional CD80 in colonic mucosa accelerated the progression of colonic carcinogenesis. Remarkably, the use of CD80ko/WT bone marrow chimeras in the AOM CRC model further demonstrated the contribute of epithelial CD80 expression to inhibition of dysplasia development. Since AOM-induced carcinogenesis is associated to oxidative stress we hypothesized that CD80 expression is upregulated in intestinal epithelial cells by reactive oxygen species (ROS). Accordingly, our in vitro experiments with intestinal epithelial CT26 and primary intestinal epithelial cells suggested that oxidative stress has a prominent role in CD80 induction. Moreover, the thoughtful investigation of CD80 up regulation induced by ROS revealed that ROS induce CD80 expression via MAPK pathways that activate STAT3 transcription factor in colon epithelial cells. Thus, we showed that CD80 is crucial in the early stages of sporadic colorectal carcinogenesis and free radicals could have a prominent role in both the mechanisms of carcinogenesis and immune surveillance triggering the immune response. Besides, the microbiota signalling has a pivotal role in intestinal colon cancer carcinogenesis. In particular, Toll-like receptors seem to regulate a wide range of biological responses including inflammatory and immune responses during carcinogenesis. In detail, TLR4 signalling has been involved in the regulation of tumour growth, survival and progression connected to inflammation but its role is still controversial in non-inflammatory carcinogenesis. Along with the histological results showing that invasive carcinoma was more frequent in TLR4 deficient mice (TLR4KO) compared to Wild Type (WT) mice both sacrificed after 8 months from the first AOM injection, flow cytometric analysis revealed that MHC expression is impaired in intestinal epithelial cells of AOM-treated TLR4KO. Accordingly, the percentage of CD8+ cytotoxic and CD4+ helper T lymphocytes decreased in AOM-treated TLR4KO proposing a less efficient presentation of the tumoral antigens and the presence of a more effective immune escape mechanism compared to the WT mice. Since microbiota plays a key role to modulate immune cells activities we next compared the gut microbiota of WT and TLR4KO by 16S rDNA sequencing and analysis of faecal SCFA (Short Chain Fatty Acids) by GC-MS. Our results showed that WT and TLR4KO display a comparable composition of the microbiota, thus excluding that the differences observed in AOM-induced CRC development are secondary to microbiota differences, generating anomalous signals to mucosal immune cells. Indeed, in vitro experiments with bone marrow derived DCs confirmed the absolute requirement of TLR4 signalling to generate mature and competent DCs. Concluding, we showed that TLR4 signalling is protective in sporadic colorectal carcinogenesis enhancing the immune response against tumour cells. This result improves the understanding of TLR4-targeted applications, its role in tumor progression and its potential use as immune modulating agent.

Il cancro al colon-retto (CRC) è uno dei tumori più frequenti in tutto il mondo sia negli uomini che nelle donne. Questo tumore è il risultato di un processo multistep in cui è presente un stretto legame tra il suo sviluppo e il sistema immunitario, la cosiddetta sorveglianza immunitaria, un processo dinamico che comprende tre diversi passaggi: eliminazione, equilibrio e fuga. Il nostro obbiettivo è stato di dimostrare che l'espressione di CD80 sulle cellule epiteliali displasiche è cruciale nel successo della sorveglianza immunitaria del CRC sporadico. I dati ottenuti dall'analisi dei pazienti dimostrano che il CD80 è sovraespresso dalle cellule epiteliali nelle lesioni pre-neoplastiche ma si riduce quando si è sviluppata una neoplasia Il CD80 è sovraespresso anche nelle prime fasi del processo di carcinogenesi nei topi trattati con AOM. Inoltre, la mancanza del CD80 funzionale nella mucosa accelera la progressione della carcinogenesi nel nostro modello murino e l'uso delle chimere supporta come l'espressione epiteliale di CD80 contribuisca all'inibizione dello sviluppo della displasia. I nostri risultati suggeriscono che l'espressione di CD80 è indotta quindi nelle lesioni preneoplastiche come meccanismo protettivo contro la degenerazione epiteliale indotta da AOM. Utilizzando la linea cellulare epiteliale intestinale CT26 e le cellule epiteliali intestinali primarie da topo, abbiamo accertato che lo stress ossidativo ha un ruolo fondamentale nell'induzione dell’espressione di CD80. Inoltre, i ROS nelle cellule epiteliali del colon inducono l'espressione di CD80 attraverso le vie attivate dalle MAP chinasi, le quali mediano la fosforilazione di STAT3. Abbiamo quindi dimostrato che il CD80 è fondamentale nelle fasi iniziali della carcinogenesi sporadica del CRC e che i ROS hanno un ruolo cruciale sia nei processi di carcinogenesi che di attivazione della sorveglianza immunitaria. Anche il microbiota ha un ruolo chiave nella carcinogenesi del cancro al colon, azione svolta probabilmente attraverso i recettori Toll-like. Nel dettaglio, il TLR4 è coinvolto nella regolazione della crescita, della sopravvivenza e della progressione tumorale connesse all'infiammazione, ma il suo ruolo è ancora controverso nella carcinogenesi non infiammatoria. Ecco che abbiamo messo in luce il ruolo protettivo dei segnali derivati dal recettore TLR4 nel modello di CRC indotto da AOM. Infatti, l’analisi istologica ha dimostrato una maggiore incidenza di carcinoma colico invasivo nei topi TLR4KO rispetto ai topi Wild Type. L'analisi citofluorimetrica ha rivelato che l'espressione del complesso maggiore di istocompatibilità I e II era alterata nei topi TLR4KO e parallelamente, la percentuale di linfociti T helper e citotossici era diminuita significativamente. Questi dati suggeriscono una minore presentazione degli antigeni tumorali da parte delle cellule epiteliali favorendo i meccanismi di fuga da parte delle cellule tumorali nei topi TLR4KO. Inoltre, abbiamo dimostrato nei topi TLR4KO un ridotto livello di cellule dendritiche mature critiche per l'attivazione delle cellule T antitumorali. Poiché il microbiota svolge un ruolo chiave nel modulare le attività delle cellule immunitarie, abbiamo confrontato il microbiota intestinale dei topi WT e TLR4KO mediante il sequenziamento dell'rDNA 16S e abbiamo quantificato gli acidi grassi a corta catena (SCFAs). I nostri risultati hanno mostrato che i due gruppi hanno una composizione comparabile del microbiota, confermando quindi che le differenze osservate non siano secondarie alla composizione del microbiota. Esperimenti in vitro utilizzando cellule dendritiche isolate dal midollo osseo hanno confermato la necessità del segnale proveniente dal TLR4 per ottenere cellule dendritiche mature e competenti. Concludendo, abbiamo dimostrato che il recettore TLR4 svolge un ruolo protettivo nella progressione della carcinogenesi colorettale sporadica, migliorando la risposta immunitaria.