Adaptation of mechanisms for regulation of photosynthetic electron transport upon land colonization

In eukaryotic organisms, oxygenic photosynthesis is catalyzed by 4 multiprotein complexes present on the thylakoid membranes inside the chloroplasts: Photosystem (PS) II, Cytochrome b6f (Cyt b6f), PSI and chloroplast ATP synthase (ATPase). The three former mediate a Linear Electron Flow (LEF) from H2O to NADP+ to synthetize NADPH. LEF also generate a proton gradient across the thylakoid membrane, supporting ATP synthesis. NADPH and ATP are exploited by Calvin Benson cycle to fix inorganic CO2 in sugars available for the metabolism. Photosynthetic process is accompanied by the formation of unstable molecules that can generate reactive oxygen species (ROS) harmful for the cell. Particular regulatory mechanisms prevent the formation of these molecules. Among these, the Alternative Electron Flow (AEF) divert electrons from photosynthetic processes preventing over-reduction of electron transporters and ROS production. AEF mechanisms can be divided in Cyclic Electron Flow (CEF) and Pseudo-CEF (PCEF) according to the acceptors of the pathways, respectively the plastoquinone and O2. Two major CEF are known and mediated by PGR5/PGRL1 or by NDH-1 complex. PCEF is instead mediated by Flavodiiron proteins (FLV). In this thesis I focused on the early land plant Physcomitrella patens, this moss presents all the main AEF identified in algae and vascular plants and is thus a suitable model to directly compared their activity in the same organisms. FLV proteins were lost in Angiosperms, one of the plausible explanations to this loss is that another AEF mechanism replaces their function, making FLV dispensable. FLV were shown to be fundamental to respond to light fluctuation that occurs in the natural environments, a function that in angiosperms was replaced by PGR5/PGRL1. To evaluate the hypothesis that PGRL1/PGR5 CEF mediated pathway can replace FLV, in chapter 3 we isolated a P. patens mutant defective for both FLV and PGRL1. Our experiments highlighted a strong synergy between the 2 pathways especially when plants were exposed to stressful light regimes, suggesting a functional overlap and the possible replacement of one pathway over the other during evolution. Further analysis allowed us to establish that FLV and PGRL1 are particularly important for protection of PSI from over-reduction, thus preventing photodamage. In chapter 4, we characterized NDH-1 complex in P. patens isolating a line defective for NDH-1 function. NDH-1 defective mutants showed a small defect in PSI functionality in the first moment after light exposure. Reiterating cycle of dark and light, the defect observed increased significantly in NDH-1 defective plants suggesting that this complex may operates in first seconds after light exposure to avoid PSI over-reduction. However, this defect did not impact the plant growth not even in fluctuating light conditions, probably because of the compensation from other mechanisms present in the chloroplast. In order to entangle this possible compensation in chapter 5 NDH-1 was depleted in plants knock out for both PGRL1 and FLV, by isolating a double mutant lacking both CEF pathways (pgrl1-ndhm) and a triple mutant defective for both CEF and PCEF (flva-pgrl1-ndhm). Both exhibited a drastic decrease in growth and photosynthetic performances showing that NDH-1 depletion has a much larger effect if other mechanisms for AEF are also absent, eliminating compensating effects. The triple mutant showed growth defects even in non-stressing conditions suggesting these mechanisms are important also for steady state photosynthesis. Spectroscopic and biochemical characterization detected extensive damage to PSI, correlated with the growth defects.

Negli organismi eucarioti la fotosintesi ossigenica è catalizzata da 4 complessi localizzati sulle membrane tilacoidali dei cloroplasti: il fotosistema (PS) II, il citocromo b6f, il PSI e l’ATPasi cloroplastica. I primi tre mediano un trasporto lineare degli elettroni (LEF) dall’H2O al NADP+ per formare NADPH. L’ATPasi invece sfrutta il gradiente protonico generato dal LEF per sintetizzare ATP. NADPH e ATP sono utilizzati dal ciclo di Calvin per fissare la CO2 in zuccheri disponibili per il metabolismo. Durante la fotosintesi si formano molecole instabili che possono generare molecole dannose per la cellula quali le specie reattive dell’ossigeno (ROS). Particolari meccanismi regolatori prevengono la formazione di queste molecole, tra questi i trasporti elettronici alternativi (AEF) rimuovono elettroni dal LEF prevenendo l’over-riduzione dei traportatori e a formazione di ROS. Gli AEF possono essere divisi in trasporti ciclici (CEF) e pseudo-ciclici (PCEF) a seconda dell’accettore finale della via, rispettivamente il plastochinone o l’O2. I due principali CEF conosciuti sono mediati dalle proteine PGR5/PGRL1 e dal complesso NDH-1. Il PCEF è invece mediato dalle proteine FLV. In questa tesi è stato studiato Physcomitrella patens, un muschio che presenta tutti i principali AEF identificati in alghe e piante vascolari ed è quindi un buon modello dove poter comparare l’attività dei diversi AEF presenti. Le proteine FLV non sono presenti nelle angiosperme, una possibile spiegazione alla loro perdita è che un altro AEF abbia sostituito il loro ruolo rendendole dispensabili. Le FLV sono importanti nella risposta alla luce fluttuante, ruolo che nelle angiosperme è ricoperto da PGR5/PGRL1. Per valutare l’ipotesi che PGR5/PGRL1 abbia rimpiazzato le FLV, nel capitolo 3 di questa tesi abbiamo isolato un mutante di P. patens difettivo per entrambe le vie. Abbiamo individuato una forte sinergia tra le 2 vie, in particolare quando i mutanti sono stati esposti a regimi luminosi restrittivi, suggerendo una sovrapposizione funzionale e un possibile sostituzione di uno con l’altro nel corso dell’evoluzione. Inoltre, abbiamo stabilito che le FLV e PGR5/PGRL1 sono importanti per proteggere il PSI dalla sovra-riduzione, prevendendo cos’ danni ossidativi. Nel capitolo 4, abbiamo caratterizzato il complesso NDH-1 di P. patens, grazie all’isolamento di una linea difettiva per la sua funzione. Questi mutanti hanno evidenziato solo una piccola differenza nella funzionalità del PSI al momento in cui le piante sono state esposte ad una luce. Reiterando cicli di buio è luce, il difetto osservato aumentava significativamente suggerendo che NDH-1 possa essere attivo nei primi secondo dopo l’esposizione ad una fonte luminosa, proteggendo il PSI. Tuttavia, anche cresciute in una condizione di luce fluttuante le piante difettive di NDH-1 non hanno mostrato fenotipi di crescita, probabilmente a causa di un meccanismo di compensazione durante il processo di acclimatazione a questa condizione. Per identificare questa possibile compensazione, nel capitolo 5 abbiamo rimosso la funzione NDH-1 in piante già mancanti di PGRL1 e FLV, isolando un doppio mutante difettivo per entrambi CEF e un triplo mutante mancante sia di CEF che di PCEF. Per Entrambi abbiamo riscontrato ridotta crescita e capacità fotosintetica, evidenziando che la funzione di NDH-1 è molto più evidente quando gli altri AEF sono assenti, eliminando l’effetto di compensazione. Il triplo mutante inoltre ha mostrato una ridotta crescita anche in condizioni non stressanti dimostrando che i AEF sono indispensabili per una corretta attività fotosintetica. Analisi spettroscopiche e biochimiche hanno mostrato che i difetti individuati sono dovuti a evidenti danni a carico del PSI in queste piante.