Functionalized polymer-derived bioceramics for bone tissue engineering

Bioceramic foams, typically containing Ca or Ca-Mg silicates, as wollastonite (CaSiO3) and diopside (CaMgSi2O6), can be obtained from the thermal treatment of preceramic polymers (silicone resins) containing micro- and nano-sized filler powders. This innovative process is advantageous because of its simplicity, the limited processing temperature and the microstructural homogeneity. These foams can simulate the natural porous internal structure of human bones, and both physical and mechanical characteristics can be modulated by varying the parameters of bioceramic formation process, consequently can be considered as promising scaffolds for bone tissue engineering. The silicate scaffolds were functionalized to add a biochemical component miming organic structure of bone, thus improving the surface-to-cells interactions, complying with the new approach of “biochemical functionalization”. The nonapeptide (HVP) from the h-Vitronectin protein (sequence 352-360) was covalently and selectively anchored on wollastonite-diopside (W/D) foams’ surfaces. In addition, a dimeric analogue (2HVP) was designed in order to increase ionic interactions with cellular GAGs and two HVP retro-inverted sequences (DHVP, retro-inverted peptide of HVP, and D2HVP, retro-inverted peptide of 2HVP) were synthesized to increase the stability toward proteolytic degradation under physiological conditions. A first screening, through in vitro bioassays showed that D2HVP gave the best results in terms of h-Osteoblasts (HOB) adhesion, proliferation, gene expression without inducing cytotoxicity when anchored to W/D foams. In particular, HOB proliferation showed a 15-folds increase for D2HVP functionalized samples with respect to the silanized foams at 6 days. A next-generation scaffold in addition to the ability to “communicate” with the surrounding cells, has to improve angiogenesis by promoting the formation of an interconnected and stable vascular network, because angiogenesis is fundamental for implant’s survival and long term integration. In order to reach this goal, we combined the proved bioactivity of D2HVP functionalized polymer-derived silicate foams with the several properties of self-assembling peptides (SAPs). Preliminary in vitro screenings were carried out to understand how different cell types (i.e. macrophages, osteoblasts and HUVECs), involved in the processes of inflammatory response, osseointegration and angiogenesis, respond to scaffolds produced by SAPs. The results of these preliminary assays showed that EAK is able to induce the formation of longer HUVEC’s tubule structures, and to promote the highest increase in HOB proliferation and YAP1 expression. In vivo assays confirmed the osteoconductive and osteoinductive properties of D2HVP peptide. All W/D scaffolds showed external and internal cell colonization with formation of new blood vessels (neoangiogenesis). Only W/D foams functionalized with D2HVP were able to stimulate the process of ectopic mineralization. In vivo results showed that EAK enriched with the pro-angiogenic sequence TIM (from Tß4) grafted to the SAP itself, have a synergistic effect in promoting mineralization. Finally, we proposed a different covalent and selective functionalization methodology that, requiring only mild reactions’ conditions and aqueous solutions can be easily transferred to all types of polymer-derived bioglass (e.g. Mg/Sr doped hardystonite), for improving their bioactivity.

Le schiume bioceramiche, tipicamente contenenti silicati di Ca o Ca-Mg, come wollastonite (CaSiO3) e diopside (CaMgSi2O6), possono essere ottenute dal trattamento termico di polimeri preceramici (resine siliconiche) contenenti fillers di dimensioni micro- e nanometriche. Questo processo innovativo è vantaggioso per la sua semplicità, per la limitata temperatura di lavorazione e l'omogeneità microstrutturale. Queste schiume simulano la naturale struttura porosa interna dell’osso trabecolare e, sia le caratteristiche fisiche che meccaniche possono essere modulate semplicemente variando i parametri iniziali del processo di produzione. Di conseguenza queste schiume possono essere considerate come scaffolds promettenti per l'ingegneria tessutale dell’osso. Gli scaffolds porosi sono stati funzionalizzati per aggiungere una componente biochimica che imiti la struttura organica dell'osso, migliorando così le interazioni superficie-cellula, attraverso l’innovativo approccio della "funzionalizzazione biochimica". Il nonapeptide (HVP) della Vitronettina (sequenza 352-360) è stato fissato in modo covalente e selettivo sulla superficie di schiume di wollastonite-diopside (W/D). Inoltre, un analogo dimerico (2HVP) è stato progettato per aumentare le interazioni ioniche con i GAG cellulari, e due sequenze retro-inverse del peptide HVP (DHVP, peptide retro-inverso di HVP e D2HVP, peptide retro-inverso di 2HVP) sono state sintetizzate per aumentare la stabilità verso la degradazione proteolitica osservata in condizioni fisiologiche. Un primo screening, attraverso prove biologiche in vitro, ha dimostrato che la sequenza D2HVP ha dato i migliori risultati in termini di adesione, proliferazione ed espressione genica di osteoblasti umani (HOB) senza indurre citotossicità quando ancorato a schiume W/D. In particolare, la proliferazione di HOB a 6 giorni su campioni funzionalizzati con D2HVP ha subito un incremento di 15 volte rispetto alle schiume silanizzate. Inoltre, uno scaffold di nuova generazione in addizione alla capacità di "comunicare" con le cellule circostanti, deve possedere l’abilità di promuovere l'angiogenesi attraverso la formazione di una rete vascolare interconnessa e stabile, fondamentale per la sopravvivenza dell'impianto e la sua integrazione a lungo termine. Per raggiungere questo obiettivo, si è voluto sommare le proprietà dei peptidi auto-assemblanti (SAP) alla comprovata bioattività delle schiume da precursori polimerici funzionalizzate con D2HVP. Sono stati effettuati screening preliminari in vitro per comprendere come differenti tipi cellulari (i.e. macrofagi, osteoblasti e HUVEC), coinvolti nei processi di risposta infiammatoria, osteointegrazione e angiogenesi, rispondano a diversi scaffolds di SAP. I risultati di questi saggi preliminari hanno dimostrato che il peptide auto-aggregante EAK è in grado di indurre la formazione di strutture tubulari più estese di HUVEC e di aumentare la proliferazione di HOB e l'espressione di YAP1. I saggi in vivo hanno confermato le proprietà osteoconduttive e osteoinduttive del peptide D2HVP. Tutti gli scaffolds di W/D sono stati colonizzati in vivo sia sulla superficie esterna che interna, con formazione di nuovi vasi sanguigni (neoangiogenesi). Solo le schiume di W/D funzionalizzate con D2HVP sono state in grado di stimolare il processo di mineralizzazione ectopica. I risultati in vivo hanno dimostrato che EAK arricchito con la sequenza pro-angiogenica TIM (da Tß4) legata covalentemente al SAP stesso, ha un effetto sinergico nel promuovere la mineralizzazione. Infine, è stata proposta una diversa metodologia di funzionalizzazione covalente e selettiva che, richiedendo solo blande condizioni di reazione e soluzioni acquose, può essere facilmente trasferita a tutti i tipi di bioceramici derivati da precursori polimerici (e.g. Hardystonite arricchita con Mg/Sr), per migliorarne la bioattività.