Peroxisomes are single-membrane bound organelles involved in reactive oxygen species scavenging, ?- and ?-oxidation of fatty acids, biosynthesis of ether phospholipids and other metabolic pathways. Although recent studies have highlighted the mechanisms of peroxisomal formation, fusion-fission, protein import etc. little information is available concerning a possible role of peroxisomes in cellular signalling, and, until very recently, no information was available about a possible role of peroxisomes in cellular Ca2+ handling. Ca2+ signalling exerts a plethora of functions in cells (both in physiology and pathology) and while the role of subcellular compartments like endoplasmic reticulum, mitochondria, nucleus and Golgi apparatus in Ca2+ handling has been intensively investigated in the last decades, peroxisomes remained a black whole in the picture. Last, but not least, a renewed interest towards peroxisome functions has been triggered by the discovery of a number of human diseases (called “peroxisomal disorders”) that are due to mutations of peroxisomal proteins. For all these reasons, I decided to investigate if and how peroxisomes play a role in cellular Ca2+ handling. I targeted a genetically encoded, FRET-based Ca2+ sensor to peroxisomal matrix and I found that the Ca2+ concentration of peroxisomes in living cells at rest is similar to that of the cytosol, while increases in cytosolic Ca2+ concentration (elicited by either Ca2+ mobilization from stores or Ca2+ influx through plasma membrane Ca2+ channels) are usually followed by a slow rise in intraperoxisomal Ca2+ concentration. I also investigated the mechanism of peroxisomal Ca2+ entry and I found that Ca2+ influx into peroxisomes is not driven by an ATP-dependent pump, membrane potential or H+ (Na+) gradients. However, the peroxisomal membrane appears to play a low-pass filter role, preventing the organelle from taking up Ca2+ during short lasting cytosolic Ca2+ transients, while allowing equilibration of the peroxisomal luminal Ca2+ concentration with that of the cytosol during prolonged cytosolic Ca2+ increases. Thus, peroxisomes appear to be an additional cytosolic Ca2+ buffer, but their influx and efflux mechanisms are unlike those of any other cellular organelle. The second part of my work was aimed at understanding the physiological function of this phenomenon. To date, no Ca2+-regulated mammalian peroxisomal enzyme is known. On the contrary, there are some Ca2+-regulated plant peroxisomal enzymes, in particular an isoform of the H2O2 scavenging enzyme catalase, Cat3. Cat3 has been shown to be specifically located in plant peroxisomes and to be activated in vitro by Ca2+ and calmodulin. The peroxisomal Ca2+ probe employed in the first part of this work was expressed in plant peroxisomes and revealed that the phenomenon of Ca2+ entry into peroxisomal matrix in plants is very similar, both in amplitude and kinetic, to that of mammalian cells. Plasma membrane hyperpolarization demonstrated to be a reliable stimulus to trigger a prolonged rise of peroxisomal (and cytosolic) Ca2+ concentration and so it was chosen in order to verify if a peroxisomal Ca2+ rise can somehow affect H2O2 scavenging. Preliminary experiments performed in Arabidopsis plants stably expressing in peroxisomes a H2O2 sensor indicate that H2O2 scavenging is accelerated by Ca2+ entry and this is correlated with the level of Cat3 within peroxisomes.

I perossisomi sono degli organelli intracellulari circondati da una singola membrana coinvolti nell’eliminazione di specie reattive dell’ossigeno, ?- e ?-ossidazione di acidi grassi, biosintesi di eteri di fosfolipidi e in altre reazioni metaboliche. Sebbene studi recenti abbiano elucidato i meccanismi alla base della formazione, della fusione- fissione e dell’importo di proteine nella matrice dei perossisomi, le informazioni riguardanti il ruolo dei perossisomi nel signalling cellulare sono scarse e, fino a poco tempo fa, quelle riguardanti il possibile ruolo dei perossisomi nel signalling cellulare del Ca2+ erano totalmente assenti. Il signalling del Ca2+ è alla base di un ampio numero di funzioni cellulari sia fisiologiche che patologiche e mentre il ruolo di compartimenti subcellulari come il reticolo endoplasmico, i mitocondri, il nucleo e l’apparato di Golgi nelle dinamiche intracellulari del Ca2+ è stato ampiamente studiato negli ultimi decenni, i perossisomi sono rimasti nella “zona d’ombra” di questo scenario. Infine, c’è stato ultimamente un rinnovato interesse circa le funzioni dei perossisomi grazie alla scoperta di un certo numero di malattie umane (chiamate “disordini dei perossisomi”) dovute a mutazioni di proteine perossisomiali. Per tutte queste ragioni, ho deciso di investigare se, e come, i perossisomi rivestono un qualche ruolo nell’omeostasi intracellulare del Ca2+. A questo scopo ho indirizzato alla matrice dei perossisomi una sonda per il Ca2+ geneticamente codificata e basata su FRET e ho potuto dimostrare che la concentrazione di Ca2+ nei perossisomi di cellule vive in condizioni di riposo è molto simile a quella citosolica mentre aumenti della concentrazione di Ca2+ (causati sia da mobilizzazione di Ca2+ dai depositi intracellulari che da influsso attraverso canali per il Ca2+ situati nella membrana plasmatica) sono solitamente seguiti da un lento aumento della concentrazione di Ca2+ nella matrice perossisomiale. Mi sono inoltre occupata della caratterizzazione del meccanismo che sta alla base dell’entrata di Ca2+ nei perossisomi e sono arrivata alla conclusione che questo fenomeno non è dovuto alla presenza di una pompa dipendente da ATP, né di un potenziale di membrana o di un gradiente di H+ o Na+. La membrana dei perossisomi sembra costituire una barriera che previene l’entrata di Ca2+ nel caso di aumenti brevi nel tempo, mentre nel caso di aumenti prolungati della concentrazione di Ca2+ nel citosol permette una lenta equilibrazione della concentrazione di Ca2+ nella matrice perossisomiale con l’ambiente citosolico. I perossisomi sembrano quindi costituire un nuovo sistema-tampone per il Ca2+del citosol, sebbene il loro meccanismo di influsso ed efflusso per il Ca2+ è totalmente differente da quello di ogni altro organello cellulare. La seconda parte del mio lavoro si è poi concentrata sullo studio dei possibili ruoli fisiologici del fenomeno dell’entrata di Ca2+ nei perossisomi. In letteratura non sono al momento riportati degli enzimi localizzati nei perossisomi delle cellule di mammifero che siano regolati da Ca2+; al contrario, alcuni enzimi localizzati nei perossisomi delle piante sembrano essere regolati da Ca2+. Di questi, quello che più mi è sembrato interessante è un’isoforma di un enzima deputato all’eliminazione di H2O2, la catalasi. L’attività di Cat3 è infatti riportata essere attivata in vitro da Ca2+ e calmodulina. La sonda per il Ca2+ utilizzata per lo studio dei perossisomi in cellule di mammifero è stata quindi indirizzata ai perossisomi di cellule vegetali e ha permesso di dimostrare che il fenomeno dell’entrata di Ca2+ nei perossisomi è molto simile, sia per ampiezza che per cinetica, tra perossisomi di mammifero e di pianta. L’iperpolarizzazione della membrana plasmatica ha dimostrato essere uno stimolo ripetibile che causa un prolungato aumento della concentrazione di Ca2+ nei perossisomi (e nel citosol) di pianta ed è quindi stato scelto per verificare se un aumento di Ca2+ nei perossisomi possa in qualche modo influenzare l’eliminazione di H2O2. Esperimenti preliminari effettuati in piante di Arabidopsis che esprimono stabilmente una sonda per H2O2 geneticamente codificata indicano che l’eliminazione di H2O2 è notevolmente accelerata in seguito all’entrata di Ca2+; questo correla con il livello di Cat3 espressa nei perossisomi.

Ca2+ homeostasis in mammalian and plant peroxisomes / Drago, Ilaria. - (2009).

Ca2+ homeostasis in mammalian and plant peroxisomes

Drago, Ilaria
2009

Abstract

I perossisomi sono degli organelli intracellulari circondati da una singola membrana coinvolti nell’eliminazione di specie reattive dell’ossigeno, ?- e ?-ossidazione di acidi grassi, biosintesi di eteri di fosfolipidi e in altre reazioni metaboliche. Sebbene studi recenti abbiano elucidato i meccanismi alla base della formazione, della fusione- fissione e dell’importo di proteine nella matrice dei perossisomi, le informazioni riguardanti il ruolo dei perossisomi nel signalling cellulare sono scarse e, fino a poco tempo fa, quelle riguardanti il possibile ruolo dei perossisomi nel signalling cellulare del Ca2+ erano totalmente assenti. Il signalling del Ca2+ è alla base di un ampio numero di funzioni cellulari sia fisiologiche che patologiche e mentre il ruolo di compartimenti subcellulari come il reticolo endoplasmico, i mitocondri, il nucleo e l’apparato di Golgi nelle dinamiche intracellulari del Ca2+ è stato ampiamente studiato negli ultimi decenni, i perossisomi sono rimasti nella “zona d’ombra” di questo scenario. Infine, c’è stato ultimamente un rinnovato interesse circa le funzioni dei perossisomi grazie alla scoperta di un certo numero di malattie umane (chiamate “disordini dei perossisomi”) dovute a mutazioni di proteine perossisomiali. Per tutte queste ragioni, ho deciso di investigare se, e come, i perossisomi rivestono un qualche ruolo nell’omeostasi intracellulare del Ca2+. A questo scopo ho indirizzato alla matrice dei perossisomi una sonda per il Ca2+ geneticamente codificata e basata su FRET e ho potuto dimostrare che la concentrazione di Ca2+ nei perossisomi di cellule vive in condizioni di riposo è molto simile a quella citosolica mentre aumenti della concentrazione di Ca2+ (causati sia da mobilizzazione di Ca2+ dai depositi intracellulari che da influsso attraverso canali per il Ca2+ situati nella membrana plasmatica) sono solitamente seguiti da un lento aumento della concentrazione di Ca2+ nella matrice perossisomiale. Mi sono inoltre occupata della caratterizzazione del meccanismo che sta alla base dell’entrata di Ca2+ nei perossisomi e sono arrivata alla conclusione che questo fenomeno non è dovuto alla presenza di una pompa dipendente da ATP, né di un potenziale di membrana o di un gradiente di H+ o Na+. La membrana dei perossisomi sembra costituire una barriera che previene l’entrata di Ca2+ nel caso di aumenti brevi nel tempo, mentre nel caso di aumenti prolungati della concentrazione di Ca2+ nel citosol permette una lenta equilibrazione della concentrazione di Ca2+ nella matrice perossisomiale con l’ambiente citosolico. I perossisomi sembrano quindi costituire un nuovo sistema-tampone per il Ca2+del citosol, sebbene il loro meccanismo di influsso ed efflusso per il Ca2+ è totalmente differente da quello di ogni altro organello cellulare. La seconda parte del mio lavoro si è poi concentrata sullo studio dei possibili ruoli fisiologici del fenomeno dell’entrata di Ca2+ nei perossisomi. In letteratura non sono al momento riportati degli enzimi localizzati nei perossisomi delle cellule di mammifero che siano regolati da Ca2+; al contrario, alcuni enzimi localizzati nei perossisomi delle piante sembrano essere regolati da Ca2+. Di questi, quello che più mi è sembrato interessante è un’isoforma di un enzima deputato all’eliminazione di H2O2, la catalasi. L’attività di Cat3 è infatti riportata essere attivata in vitro da Ca2+ e calmodulina. La sonda per il Ca2+ utilizzata per lo studio dei perossisomi in cellule di mammifero è stata quindi indirizzata ai perossisomi di cellule vegetali e ha permesso di dimostrare che il fenomeno dell’entrata di Ca2+ nei perossisomi è molto simile, sia per ampiezza che per cinetica, tra perossisomi di mammifero e di pianta. L’iperpolarizzazione della membrana plasmatica ha dimostrato essere uno stimolo ripetibile che causa un prolungato aumento della concentrazione di Ca2+ nei perossisomi (e nel citosol) di pianta ed è quindi stato scelto per verificare se un aumento di Ca2+ nei perossisomi possa in qualche modo influenzare l’eliminazione di H2O2. Esperimenti preliminari effettuati in piante di Arabidopsis che esprimono stabilmente una sonda per H2O2 geneticamente codificata indicano che l’eliminazione di H2O2 è notevolmente accelerata in seguito all’entrata di Ca2+; questo correla con il livello di Cat3 espressa nei perossisomi.
2009
Peroxisomes are single-membrane bound organelles involved in reactive oxygen species scavenging, ?- and ?-oxidation of fatty acids, biosynthesis of ether phospholipids and other metabolic pathways. Although recent studies have highlighted the mechanisms of peroxisomal formation, fusion-fission, protein import etc. little information is available concerning a possible role of peroxisomes in cellular signalling, and, until very recently, no information was available about a possible role of peroxisomes in cellular Ca2+ handling. Ca2+ signalling exerts a plethora of functions in cells (both in physiology and pathology) and while the role of subcellular compartments like endoplasmic reticulum, mitochondria, nucleus and Golgi apparatus in Ca2+ handling has been intensively investigated in the last decades, peroxisomes remained a black whole in the picture. Last, but not least, a renewed interest towards peroxisome functions has been triggered by the discovery of a number of human diseases (called “peroxisomal disorders”) that are due to mutations of peroxisomal proteins. For all these reasons, I decided to investigate if and how peroxisomes play a role in cellular Ca2+ handling. I targeted a genetically encoded, FRET-based Ca2+ sensor to peroxisomal matrix and I found that the Ca2+ concentration of peroxisomes in living cells at rest is similar to that of the cytosol, while increases in cytosolic Ca2+ concentration (elicited by either Ca2+ mobilization from stores or Ca2+ influx through plasma membrane Ca2+ channels) are usually followed by a slow rise in intraperoxisomal Ca2+ concentration. I also investigated the mechanism of peroxisomal Ca2+ entry and I found that Ca2+ influx into peroxisomes is not driven by an ATP-dependent pump, membrane potential or H+ (Na+) gradients. However, the peroxisomal membrane appears to play a low-pass filter role, preventing the organelle from taking up Ca2+ during short lasting cytosolic Ca2+ transients, while allowing equilibration of the peroxisomal luminal Ca2+ concentration with that of the cytosol during prolonged cytosolic Ca2+ increases. Thus, peroxisomes appear to be an additional cytosolic Ca2+ buffer, but their influx and efflux mechanisms are unlike those of any other cellular organelle. The second part of my work was aimed at understanding the physiological function of this phenomenon. To date, no Ca2+-regulated mammalian peroxisomal enzyme is known. On the contrary, there are some Ca2+-regulated plant peroxisomal enzymes, in particular an isoform of the H2O2 scavenging enzyme catalase, Cat3. Cat3 has been shown to be specifically located in plant peroxisomes and to be activated in vitro by Ca2+ and calmodulin. The peroxisomal Ca2+ probe employed in the first part of this work was expressed in plant peroxisomes and revealed that the phenomenon of Ca2+ entry into peroxisomal matrix in plants is very similar, both in amplitude and kinetic, to that of mammalian cells. Plasma membrane hyperpolarization demonstrated to be a reliable stimulus to trigger a prolonged rise of peroxisomal (and cytosolic) Ca2+ concentration and so it was chosen in order to verify if a peroxisomal Ca2+ rise can somehow affect H2O2 scavenging. Preliminary experiments performed in Arabidopsis plants stably expressing in peroxisomes a H2O2 sensor indicate that H2O2 scavenging is accelerated by Ca2+ entry and this is correlated with the level of Cat3 within peroxisomes.
Calcium, FRET, peroxisomes, catalase
Ca2+ homeostasis in mammalian and plant peroxisomes / Drago, Ilaria. - (2009).
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