FAM, a deubiquitinating enzyme essential for TGFbeta signaling controls Smad4 monoubiquitination

How growth factors can direct cell behavior depending on strength and duration of the signal remains a central unanswered question in cell and developmental biology. TGFb serves as paradigm example, as this pathway induces distinct cell fates depending on the levels of nuclear complexes formed by Smad4 with receptor phosphorylated RSmads. To serve reliably as quantitative signal, the assembly of the Smad4/RSmad complex must be not only positively regulated by receptors, but also actively kept under negative control. Yet, the factors responsible for the latter are only now starting to emerge. We found that Smad4 monoubiquitination is a central mechanism by which cells inhibit Smad4/RSmad complex assembly. By mean of siRNA screen we identified FAM (Usp9x) as a new enzyme acting as essential and evolutionary conserved component in TGFb and BMP signaling. Smad4 is monoubiquitinated in lysine 519 in vivo and this modification renders Smad4 a latent factor, impeding association with phospho- Smad2. FAM is the DUB that reverts this negative modification, re- empowering Smad4 activity. The activity of FAM is cytoplasmic and opposite to that one of Ectodermin/Tif1g(Ecto), a nuclear factor for which we now clarify a prominent role as Smad4 K519- monoubiquitin ligase. Loss of FAM leads to increased Smad4 monoubiquitination and repression of Smad4-dependent TGF? and BMP responses, whereas loss of Ecto has opposite effects. Critically, these enzymes operate in the same pathway, being Ecto function required downstream of FAM. Intriguingly, the activity of Ecto on Smad4 is fostered by its association with P-Smad2, indicating that Ecto may also serve in vivo as “disruptase” of the Smad2/Smad4 complex. Thus, we suggest that Smad4 monoubiquitination provides a novel and powerful mechanism by which cells can quantitatively tune their responsiveness to TGFb.

Come i fattori di crescita possano influenzare il comportamento cellulare sulla base dell’intensità e della durata del segnale rimane una questione irrisolta nel campo della biologia cellulare e dello sviluppo. TGFb ne è un esempio paradigmatico, in quanto questo segnale induce differenti destini cellulari in dipendenza dei livelli nucleari del complesso formato da Smad4 assieme alle Rsmads fosforilate. Per poter agire quantitativamente, la formazione dei complessi Smad4/RSmad non deve essere regolata solo positivamente dai recettori, ma anche negativamente in modo attivo. I fattori responsabili di questo controllo negativo stanno cominciando solo ora ad essere scoperti. Nel nostro studio abbiamo verificato come la monoubiquitinazione di Smad4 sia un meccanismo centrale nell’inibire la formazione del complesso Smad4/RSmad. Attraverso uno screening con siRNA abbiamo identificato FAM (Usp9x) come una nuova deubiquitinasi (DUB) che agisce come componente essenziale ed evolutivamente conservato nelle vie di segnale TGFb e BMP. Smad4 è monoubiquitinata in vivo a livello della lisina 519: questo la rende un fattore latente e ne impedisce l’associazione con fosfo-Smad2. FAM è la DUB che rimuove questa modificazione negativa ripristinando l’attività di Smad4. L’attività di FAM è citoplasmatica ed opposta a quella di Ectodermin/Tif1g(Ecto), un fattore nucleare per il quale proponiamo un ruolo come monoubiquitina ligasi di Smad4. La inattivazione di FAM porta all’aumento di monoubiquitinazione ed alla repressione delle risposte a TGFb e BMP dipendenti da Smad4; la inattivazione di Ecto ha effetti opposti. Questi enzimi agiscono nella stessa pathway, poiché la inattivazione di Ecto è dominante rispetto a quella di FAM. E’ interessante notare come l’attività di Ecto su Smad4 sia favorita dalla sua associazione con fosfo-Smad2, indicando un possibile ruolo di Ecto come “disassemblatore” del complesso Smad2/Smad4.Per questi motivi proponiamo che la monoubiquitinazione di Smad4 sia un nuovo e potente meccanismo attraverso cui le cellule possono regolare quantitativamente la loro responsività a TGFb.