Studi biochimici e funzionali di due [FeFe]-idrogenasi

Hydrogenases, a family of metalloenzymes that produce molecular hydrogen (H2) from protons and electrons according to the equation 2H+ + 2e- ? H2, seem to be very promising in terms of bio-hydrogen production as non-polluting fuel. At present, two major difficulties slow the progress and the achievements of a bio-H2-based biotechnology in the field of renewable energies: i) the low efficiency of conversion, in term of energy employed to produce molecular hydrogen and ii) the extreme sensitivity to molecular oxygen, a key feature of most hydrogenases that remains yet misunderstood and imposes to these processes a condition of strict anaerobiosis. In this context, only an extensive study on the molecular mechanisms of both catalytic activity and oxygen intolerance of hyrogenases could overcome these obstacles. My PhD project focused on the preliminary biochemical and fuctional characterization of [FeFe]-hydrogenases from Enterobacter cloacae and Thermotoga neapolitana. The first hydrogenase I studied was the one from E. cloacae IIT-BT 08, a high yield H2 producing bacterial strain. This protein is much smaller than previously known [FeFe]-hydrogenases, yet retaining a high catalytic activity, and could represent a good model to study the mechanism of catalysis of more complex hydrogenases. In this work I obtained, in conditions of strict anaerobiosis, a partially pure recombinant StrepII-tagged [FeFe] hydrogenase from E. cloacae, which has been analyzed by preliminar biochemical studies, including iron content determination, EPR analysis and activity assay. Based on the results of these analysis, I concluded that this protein shows no evidence for an hydrogenase, thus supporting the general skepticism of the scientific community about the E. cloacae enzyme. In the second part of my work I studied the T. neapolitana hydrogenase. T. neapolitana is a hyperthermophilic microorganism which is able to grow and produce hydrogen gas even in microaerobic conditions; for this reason, its enzyme, one of most complex [FeFe]-hydrogenases, never charaterized before, could be a best model to describe the oxygen tolerance of this class of enzymes. In order to investigate on the potential oxygen tolerance of this protein, I expressed it in a E. coli based heterologous system and I obtained a functional enzyme. With this set up, I would investigate the oxygen tolerance of T. neapolitana hydrogenase by means of a site-directed mutagenesis based structure-function relationship study. The last part of my work was dedicated to the study of one interesting [FeFe]-hydrogenase maturase, the HydF protein, from T. neapolitana. Because all [FeFe]-hydrogenases share a very uncommon and complex active site, they requires a special set of maturase proteins for their biosynthesis. Three of these maturases, HydE, HydF and HydG, recently discovered, are present in all organisms containing [FeFe]-hydrogenases and are extremely important for the functionality of this enzymes. In order to elucidate the structure and function of this HydF protein, which are still unknown, I overexpressed it in E. coli cells, purified it and crystallized it. Furthermore, in this study I discovered a new feature of this protein, which is present in solution only in two oligomeric forms (dimer and tetramer), which have been isolated and subjected to crystallization and X-ray analysis.

Le idrogenasi, una famiglia di metallo enzimi che catalizzano la produzione di idrogeno molecolare (H2) da protoni ed elettroni secondo l'equazione 2H+ + 2e- ? H2, sembrano essere molto promettenti in termini di bioproduzione di idrogeno come processo per l’ottenimento di energia pulita e rinnovabile. In questo contesto, tuttavia, esistono due limiti molto importanti che ostacolano lo sviluppo di applicazioni biotecnologiche per la bioproduzione di idrogeno su larga scala: i) una bassa efficienza di conversione, in termini di energia impiegata per l’ottenimento di idrogeno molecolare e ii) una severa inibizione, in molti casi irreversibile, da parte dell’ossigeno molecolare, che impone un ambiente strettamente anaerobico per la produzione di idrogeno. Tali limiti possono essere superati chiarendo a livello molecolare i meccanismi alla base sia della catalisi enzimatica che porta alla produzione di idrogeno che dell’inibizione di questi enzimi da parte dell’ossigeno, non ancora del tutto compresi. Il mio lavoro di dottorato è stato focalizzato sullo studio biochimico e funzionale di due [FeFe]-idrogenasi, gli enzimi di Enterobacter cloacae e di Thermotoga neapolitana. In particolare, nella prima parte del lavoro mi sono occupata dell’espressione dell’enzima di E. cloacae nel sistema eterologo E. coli e della sua parziale caratterizzazione biochimica e funzionale; tale enzima, che era stata proposta come la più piccola idrogenasi ad oggi isolata, poteva infatti offrire un ottimo modello per lo studio dell’organizzazione molecolare e funzionale di [FeFe]-idrogenasi più complesse. Tuttavia, i dati ottenuti da diverse studi biochimici, tra cui analisi del sito attivo mediante EPR e verifica dell’attività idrogenasica, portano a concludere che non esiste alcuna evidenza strutturale e funzionale che la proteina ricombinante di E. cloacae sua effettivamente una [FeFe]-idrogenasi e confermano il diffuso scetticismo della comunità scientifica intorno a questo enzima. La seconda parte del lavoro è stata dedicata allo studio della [FeFe]-idrogenasi di T. neapolitana, un enzima trimerico molto cmplesso che non è mai stato isolato e caratterizzato. Il batterio ipertermofilico T. neapolitana è capace di produrre idrogeno anche in presenza di micro-concentrazioni di ossigeno molecolare; pertanto, la sua idrogenasi potrebbe rappresentare un buon modello per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensibilità all’ossigeno di questa classe di enzimi. L’espressione della [FeFe]-idrogenasi di T. neapolitana in E. coli in forma funzionale ha consentito di ottenere un sistema di studio utile per approfondire la diversa sensibilità di tale proteina all’ossigeno. Con questo sistema sarà possibile valutare in vitro la massima percentuale di ossigeno compatibile con la sua attività catalitica e condurre un approccio di mutagenesi sito-specifica volta a comprendere il meccanismo molecolare alla base dell’inibizione. L’ultima parte del mio lavoro è stata focalizzata sull’analisi strutturale della proteina HydF di T. neapolitana, coinvolta nel complesso meccanismo di maturazione della [FeFe]-idrogenasi, ancora oggi largamente sconosciuto. In particolare, tutte le [FeFe]-idrogenasi presentano un sito attivo complesso ed insolito e necessitano pertanto di diverse proteine per la loro maturazione; tre di queste maturasi, denominate HydE, HydF, ed HydG, precedentemente identificate e riscontrate in tutti gli organismi contenenti [FeFe]-idrogenasi, sembrano essere necessarie e sufficienti per l’ottenimento di un enzima attivo. L’espressione eterologa della proteina di maturazione HydF di T. neapolitana in E. coli ha evidenziato per la prima volta che la proteina in soluzione si presenta come oligomero, in forma dimerica e tetramerica. Sono stati ottenuti diversi cristalli della proteina, la cui analisi mediante diffrazione a raggi X potrà fornire numerose informazioni sul suo meccanismo d’azione nel folding delle[FeFe]-idrogenasi, un soggetto di ricerca che sta ricevendo oggi una crescente attenzione