Role of the transcription factor MRF4 in adult skeletal muscle

Myogenesis is a dynamic process in which mononucleated undifferentiated myoblasts first proliferate, then withdraw from the cell cycle and finally differentiate and fuse to form the multinucleated mature muscle fibers. This process is controlled by members of a family of muscle-specific basic helix-loop-helix (bHLH) proteins that, in concert with members of the ubiquitous E2A and myocytes enhancers factor 2 (MEF2) families, activate the differentiation program by inducing transcription of regulatory and structural muscle specific gene. The MRF proteins contains one or two transactivation domain, a conserved basic DNA-binding domain essential for sequence-specific DNA binding, and an HLH motif required for heterodimerization. MRFs specific knockout studies suggest that MyoD and Myf5 are required for commitment to the myogenic lineage, whereas myogenin plays a critical role in the expression of the terminal muscle phenotype; Mrf4 partly subserves both roles. In the adult skeletal muscle, the expression of MRFs considerably changes: Myf5 is not expressed in adult fibers, MyoD and myogenin are expressed at low levels and respectively in fast muscle and in slow muscle, Mrf4 is the only muscle regulatory factors expresses at high levels in adult skeletal muscle, but its role is still unknown. The aim of this work is study the expression and the physiological role of Mrf4 in the adult skeletal muscle. We demonstrate that Mrf4 is similarly expressed at mRNA and protein levels in the slow soleus muscle and in the fast EDL muscle, but this transcription factor has a predominantly nuclear localization in soleus and a predominantly cytosolic localization in EDL. We also demonstrate that Mrf4 expression is activity dependent using two experimental models: elettrostimulation and denervation (inactivity condition). When EDL muscles were stimulates with a slow pattern, Mrf4 translocates to the nucleus, whereas with a fast pattern Mrf4 remains in the cytoplasm. Moreover, after denervation Mrf4 accumulates in to the nucleus. This observation suggests that MRF4 may undergo nucleo-cytoplasmic shuttling, as in the case of other transcription factors, but not describes for the MRFs. To get further insight about the function of Mrf4 in adult muscle we examined the effect of Mrf4 overexpression and knockdown using an in vivo transfection approach in adult rat skeletal muscles. We evaluated if Mrf4 is involved in the regulation of two features of muscle phenotype: the muscle growth and the fiber type specification. Muscle growth: we demonstrate that Mrf4 silencing in adult and regenerating muscles induces hypertrophy. On the other hand, the overexpression of Mrf4 cDNA in regenerating muscles, but not in the adult muscles, causes a decrease of cross sectional area of transfected fibers. Moreover the MRF4 knockdown prevents denervation atrophy. This data suggest that Mrf4 acts as a negative regulator of muscle fiber growth. Fiber type specification: we used two luciferase reporter under control of the MyHC slow (MyHC slow-Luc) and the MyHC 2B (MyHC 2B-Luc) promoter. We demonstrate that Mrf4 knockdown in adult skeletal muscle inhibits the activity of MyHC slow-Luc and induces the activity of MyHC 2B-Luc; on the other hand, this reporter is activated by Mrf4 overexpression. We have also study the effect of Mrf4 silencing on endogenous gene: we demonstrate that Mrf4 knockdown blocks the expression of endogenous MyHC slow. This data suggest that Mrf4 is involved in the induction and in the maintenance of slow gene program.

Lo sviluppo del muscolo scheletrico è controllato da una famiglia di fattori trascrizionali, chiamati Muscle Regulatory Factors (MRFs), i cui membri sono MyoD, Myf5, Mrf4 e miogenina. Questi fattori trascrizionali sono in grado di dare inizio al programma miogenico, convertendo cellule non muscolari in derivati miogenici. Gli MRFs appartengono alla famiglia di proteine bHLH (basic helix-loop-helix) e presentano motivi strutturali caratteristici: uno o due domini di transattivazione, un dominio basico di legame al DNA molto conservato e la regione HLH, necessaria per l’eterodimerizzazione. È stato osservato in vitro ed in vivo che i fattori MRF sono in grado di eterodimerizzare con un’altra famiglia di proteine bHLH, le proteine E, e di legarsi al DNA su una sequenza consenso specifica, detta E box (CANNTG). Questo legame permette l’attivazione trascrizionale di specifici geni muscolari, come ?-actina, MCK (Muscle Creatin Kinase) e troponina I. L’analisi di diversi knockout degli MRFs ha permesso di definire ruoli diversi nello sviluppo muscolare per i vari membri della famiglia. In particolare, Myf5 e MyoD sono induttori del programma miogenico, mentre miogenina ha un’azione fondamentale nelle fasi successive del differenziamento dei mioblasti. Mrf4 è l’unico fattore ad essere coinvolto sia nella fase iniziale di induzione, che in stadi avanzati del differenziamento miogenico. Nel muscolo scheletrico adulto l’espressione degli MRFs viene mantenuta, ad eccezione di Myf5. In particolare, MyoD e miogenina sono espressi a livelli bassi, e sono più abbondanti rispettivamente nelle fibre di tipo rapido e di tipo lento. Mrf4 è l’unico dei quattro fattori trascrizionali a mantenere livelli di espressione molto elevati nel muscolo scheletrico adulto, ma la sua distribuzione in diversi tipi di muscoli (rapidi e lenti) ed il suo ruolo fisiologico non sono stati ancora caratterizzati. Questo progetto ha avuto come obiettivo principale quello di definire il profilo di espressione e il ruolo di Mrf4 nel muscolo scheletrico adulto. Abbiamo pertanto analizzato l’espressione di Mrf4 in un muscolo tipicamente lento, il soleo, ed in un muscolo rapido, l’extensor digitorum longus (EDL). I nostri risultati indicano che la sua espressione è paragonabile nei due tipi di muscoli, sia a livello di mRNA che a livello di proteina. Abbiamo invece messo in luce delle differenze nella localizzazione di Mrf4, che risulta essere prevalentemente nucleare nel soleo, mentre l’EDL presenta solo alcuni nuclei positivi ed una marcatura diffusa nel citoplasma. Per chiarire se l’espressione di Mrf4 fosse controllata dall’attività nervosa, ci siamo serviti di due modelli sperimentali in vivo su ratto: l'eletrostimolazione e la denervazione (condizione di inattività). Mrf4, in seguito a stimolazione di tipo lento, trasloca nei nuclei, mentre rimane nel citosol se stimolato con un pattern di tipo rapido. In seguito a denervazione Mrf4 sia accumula nei nuclei sia nel soleo che nell’EDL. Queste osservazioni suggeriscono che Mrf4 possa andare incontro ad un fenomeno di shuttling nucleo-citoplasmatico, fenomeno comune a vari fattori trascrizionali ma non descritto nel caso degli MRFs. Per comprendere il suo ruolo fisiologico nel muscolo scheletrico adulto, abbiamo effettuato esperimenti di iperespressione e di silenziamento genico. Abbiamo valutato se Mrf4 potesse essere coinvolto nella regolazione di due aspetti del fenotipo muscolare: la crescita e la specificazione del tipo di fibre. Regolazione della crescita muscolare: abbiamo dimostrato che il silenziamento genico di Mrf4 in muscoli adulti e rigeneranti induce ipertrofia delle fibre trasfettate; per contro l’iperespressione di Mrf4 in muscoli rigeneranti, ma non adulti, causa una diminuzione dell’area delle fibre trasfettate. Abbiamo inoltre dimostrato che Mrf4 previene l’atrofia indotta da denervazione. Questi dati suggeriscono che Mrf4 agisce come regolatore negativo della crescita. Specificazione del tipo di fibra: abbiamo utilizzato due reporter luciferasi sotto il controllo dei promotori della catena pesante della miosina lenta (MyHC slow-Luc) e della miosina rapida 2B (MyHC 2B-Luc). Abbiamo dimostrato che il silenziamento genico di Mrf4 in muscolo scheletrico adulto inibisce l’attività del reporter MyHC slow-Luc mentre induce quella del reporter MyHC 2B-Luc. Al contrario l’iperespressione di Mrf4 con il promotore della miosina rapida induce diminuzione dell’attività, mentre non modifica l’attività della miosina lenta. Abbiamo inoltre analizzato l’effetto del silenziamento di Mrf4 su geni endogeni in muscolo rigenerante e abbiamo dimostrato che il silenziamento genico di Mrf4 blocca l’espressione della miosina lenta indotta dal nervo. Questi esperimenti dimostrano quindi che Mrf4 attiva il programma genico lento e inibisce quello rapido, contribuendo ai meccanismi di induzione e di mantenimento dei programmi genici coinvolti nella specificazione del tipo di fibra.