Insights into the functionality and druggability of the homodimerization of human papillomavirus E6 oncoprotein

High-risk human papillomaviruses (HR-HPV), typified by HPV16 and HPV18, are the cause of several epithelial cancers, including cervical, oropharyngeal, and anogenital carcinomas. The mechanisms by which HR-HPV infections lead to malignant cell transformation rely mainly on the activities of two viral oncoproteins, E6 and E7, which synergistically act to transform and immortalize the infected cell. E6 is considered the main oncoprotein responsible for cellular transformation, since its sustained expression and transforming activity are key elements for tumor progression. Recent structural and mutational studies revealed the importance of a conserved alpha-helix (α2) in the N-terminal domain of E6 for the productive degradation of p53. Indeed, a few key residues of the α2-helix form a hydrophobic pocket on E6 protein surface which was shown to be crucially involved in the interaction with p53. Notably, the α2-helix was previously characterized to be important also for E6 self-association, an event poorly understood that involves the same amino acids important for the binding to p53. Thus, the hydrophobic pocket corresponding to the α2-helix of E6 seems to be important for different protein-protein interactions and represents a new attractive target for the development of anti-E6 compounds, since no specific anti-HPV drugs exist so far. In the present PhD thesis we demonstrate that HPV16 E6 can dimerize not only in vitro but also in cells, and the dimerization is specifically driven by the α2-helix. In addition, our results suggest that the homodimerization of E6 is not required for the degradation of p53 and thus these two interactions, i.e., the binding of E6 to p53 and E6 self-association, likely occur independently of each other and probably in different cellular compartments. Furthermore, we observed that E6 induces the upregulation of TAZ which is, together with YAP, the main transducer of the Hippo signaling pathway, controlling organ size, tumorigenesis and metastasis. Strikingly, this process seems to require E6 self-association, since dimerization-defective E6 mutants are unable to upregulate TAZ in transfected cells. Finally, with the goal to develop dual inhibitors that could block the protein-protein interactions occurring on the α2-helix of the viral oncoprotein, we performed in silico drug screenings, taking advantage of the available structural models, and identified some candidate compounds fitting on the hydrophobic core of the α2-helix of E6. We then evaluated their ability to impair both E6 self-association and the E6-mediated degradation of p53. Strikingly, we identified one compound able to block both interactions, thus representing a candidate dual inhibitor, which could also induce the downregulation of E6 protein levels in parallel to its ability to rescue p53 in transfected cells. This compound also exhibited specific anti-proliferative and anti-clonogenic activities against HPV-positive cells. In conclusion, the present study successfully investigated and elucidated the potential role of E6 homodimerization with regard to the transforming activities of the viral oncoprotein, and demonstrated that targeting the α2-helix of high-risk E6 proteins may represent a novel fascinating strategy for the development of anti-E6 compounds.

I papillomavirus umani ad alto rischio (HR-HPV), rappresentati dai genotipi 16 e 18, sono causa di diversi tumori epiteliali, inclusi carcinomi della cervice uterina, dell’orofaringe e anogenitali. I meccanismi attraverso i quali le infezioni da HR-HPV portano alla trasformazione cellulare maligna, si basano sulle attività di due oncoproteine virali, E6 ed E7, le quali agiscono sinergisticamente per trasformare ed immortalizzare le cellule infettate. E6 è considerata la principale oncoproteina responsabile della trasformazione cellulare, in quanto la sua prolungata espressione ed attività trasformante sono elementi chiave per la progressione del tumore. Alcuni recenti studi strutturali e mutazionali hanno rivelato l’importanza di un’alfa elica (α2) nel dominio N-terminale di E6, altamente conservata tra i vari genotipi di HR-HPV, per la degradazione di p53. Infatti, è stato visto che alcuni residui chiave di quest’alfa elica formano una tasca idrofobica sulla superficie di E6 cruciale per l’interazione con p53. In più, era stato visto anche che quest’alfa elica media l’autoassociazione di E6, un processo che, sebbene poco caratterizzato, coinvolge gli stessi aminoacidi necessari per il legame a p53. Perciò, la tasca idrofobica corrispondente all’elica α2 di E6 sembra essere importante per diverse interazioni proteina-proteina e rappresenta un nuovo affascinante target per lo sviluppo di composti anti-E6, considerato che ad oggi non esistono ancora farmaci contro HPV. In questa tesi di dottorato dimostriamo come E6 di HPV16 possa dimerizzare non solo in vitro ma anche nelle cellule, e come la dimerizzazione di E6 sia mediata specificamente dall’elica α2. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che la dimerizzazione di E6 non è necessaria per la degradazione di p53 e che quindi queste due interazioni proteina-proteina, cioè il legame di E6 a p53 e l’autoassociazione di E6, possano avvenire indipendentemente l’una dall’altra e probabilmente in compartimenti cellulari diversi. In aggiunta abbiamo osservato che E6 stabilizza i livelli di TAZ che, assieme a YAP, è il principale effettore della via di segnalazione Hippo, che regola la crescita degli organi ed anche i processi di tumorigenesi e di metastasi. Sorprendentemente, questo processo pare richiedere l’autoassociazione di E6, in quanto mutanti di E6 incapaci di dimerizzare, sono incapaci anche di stabilizzare TAZ in cellule trasfettate. Infine, con l’obiettivo di sviluppare inibitori duplici che possano bloccare entrambe le interazioni proteina-proteina che coinvolgono l’elica α2 dell’oncoproteina virale, abbiamo condotto degli screening in silico utilizzando i modelli strutturali disponibili in letteratura e abbiamo identificato alcuni composti in grado di legarsi al core idrofobico dell’elica α2 di E6. Abbiamo quindi valutato la loro capacità di interferire sia con l’autoassociazione di E6 che con la degradazione di p53 indotta da E6. Sorprendentemente, un composto si è rivelato capace di bloccare entrambe le interazioni, rappresentando quindi un potenziale inibitore duplice, e ha mostrato anche le capacità di indurre una diminuzione dei livelli di E6 in parallelo alla sua abilità di prevenire la degradazione di p53 in cellule trasfettate. In più, questo composto ha mostrato anche attività anti-proliferative e anti-clonogeniche specifiche contro cellule HPV-positive. In conclusione, questo studio ha investigato con successo e chiarito il potenziale ruolo della dimerizzazione di E6 relativamente alle attività trasformanti dell’oncoproteina virale, e ha dimostrato che colpire l’elica α2 di E6 può rappresentare una strategia innovativa per lo sviluppo di composti anti-E6.