Analysis of the Expression of Pro-Inflammatory Cytokines and Vascular Adhesion Molecules in Cirrhotic Patients with or without Hepatocarcinoma

Background: Hepatocarcinoma (HCC) is the fifth most commonly diagnosed cancer and the second cause of cancer death in men worldwide, while in women represents the seventh most frequently diagnosed cancer and the sixth leading cause of cancer related death. HCC incidence is 10-20/100.000 per year and its mortality rate is 16/100.000 per year. 70-90% of patients are affected by liver cirrhosis and indeed this represents the greatest risk factor for HCC. Worldwide almost 54% of HCC is attributable to HBV infections, while 30% are caused by HCV and 15% by alcohol consumption. During progression from chronic liver disease to cirrhosis and then HCC, inflammation plays a pivotal role through changes in the hepatic microenvironment. Key factors are the cytokines IL-6 and Tumour Necrosis Factor α (TNF), and the adhesion proteins Vascular Adhesion Protein 1 (VAP-1), Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) and Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1). Aims: The main aim of the study is to evaluate IL-6, TNF, VAP-1, ICAM-1 and VCAM-1 expression in serum samples of cirrhotic patients with and without HCC, thereby giving an interpretation of the role played by inflammation in the carcinogenetic process. Secondary endpoints are the identification of prognostic markers and future therapeutic targets. Materials and Methods: Eighty consecutive patients with cirrhosis followed as outpatient controls between 2002 and 2012 were included. Twenty-two patients were affected by alcoholic cirrhosis, while fifty-eight presented liver cirrhosis and HCC. In the group of patients with HCC, forty-four patients underwent loco-regional therapies, whereas fourteen underwent surgery. Evaluation of cirrhosis was carried out by Child-Pugh, MELD and MELD-Na staging systems, ascites, encephalopathy, α-fetoprotein levels (αFP), tumour size and overall survival in HCC patients. A group of 20 healthy patients was used as control group. The evaluation of VAP-1 serum levels was performed by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA - Bender MedSystems GmbHc) carried out on plasma samples after defrosing. The evaluation of the inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) and of the adhesion soluble forms of cell adhesion proteins (ICAM-1 and VCAM-1) were performed by Bio-Plex system (kit Bio-Plex Pro™ kit - Bio-Rad) carried out on plasma samples after defrosting. Numerical data were expressed as mean and standard deviation and compared with Student’s t-test, while for categorical variables count and percentage in each category are reported and compared with Wilcoxon test. Cox regression and KaplanMeier method were performed for the survival study. Statistical significance was declared for P-value <0.05. The statistical analysis was performed with STATA/SE 11.1 (StataCorpLP, College Station, Texas, USA). Results: The analysis of the expression of pro-inflammatory proteins revealed that VAP-1 (p=0.001) and VCAM-1 (p=0.005) were significantly higher in cirrhotic patients without HCC compared to those with cancer. No statistical difference was assesed in levels of TNF, IL-6, ICAM-1, α-FP between the two groups. The group of patients treated with medical therapy showed a mean of 5-years survival of 42% and a median life expectancy of 38 months, while surgical patients showed a mean 5-years survival of 55% and a median life expectancy of 97 months. The univariate analysis demonstrated a statistical significance with a negative correlation with prognosis for ascites (p=0,012, HR 2,7, CI 95% 1,24-5,85) and tumor size (p=0,027, HR 1,01, CI 95% 1,24-5,85). No statistical significance was found at univariate analysis for the other parameters (IL-6, TNF-α, VAP-1, ICAM-1, VCAM-1, Child-Pugh, MELD, MELD-Na, Encephalopathy, αFP ). At multivariate analysis, tumor size and ascites were shown to be statistically significant, with a p respectively of 0.033 (HR 1,01, CI 95% 1,00083-1,02) and 0.02 (HR 2,54, CI 95% 1,159-5,57). Conclusions: In this study VAP-1 and VCAM-1 were significantly higher in cirrhotic patients without HCC than in those with cancer. This could suggest a role of these molecules in the immune control. Even if in literature ICAM-1 is reported to have a higher expression in patients with cancer, in this study the analysis didn’t show any differences between the groups. The hypothesis to be investigated is if the upregulation of ICAM-1 could lead the loss of immune control against the neoplasm. Moreover, also IL-6 and TNF were not statistically significant. Concerning to the prognostic impact, only the two clinical parameters ascites and tumor size were statistically significante with a negative correlation with prognosis, while none of the molecules have any correlation. These preliminary results are not conclusive and further studies are needed to clarify the intriguing role of cytokines and vascular adhesion protein in carcinogenesis and their prognostic value. The main limit of this paper is the lack of uniformity of the population studied. The different rate of staging subgroups in the various population may have affected the statistical analysis. A prospective case-control study is the next postdoc research topic. The first endpoint will be the homogenization of the population to be studied, thus allowing the evaluation of patients by stage (Child-Pough; Meld) and by etiology of cirrhosis (alcoholic, HBV, HCV), and furthermore making a comparison between the different categories and subgroups. Furthermore, as secondary endpoint, the study will focus on finding potential therapeutic targets and the subsequent therapeutic implication.

Introduzione: L’epatocarcinoma (HCC) è la sesta neoplasia e la terza causa di morte per cancro a livello mondiale. La sua incidenza in Italia è di circa 10-20 casi/100.000 all’anno. Il principale fattore di rischio per HCC è la cirrosi epatica e infatti il 70-90% di pazienti con HCC ne è affetto. Nel 54% dei casi i pazienti con HCC hanno un’infezione da HBV, nel 31% da HCV ed nel 15% un’epatopatia da abuso alcolico. L’infiammazione, attraverso l’alterazione del microambiente epatico, gioca un ruolo fondamentale nel passaggio da epatopatia a cirrosi e infine a HCC. Fattori chiave dell’infiammazione indotta dall’alcool sono le citochine IL-6 e il Tumour Necrosis Factor α (TNF), e le proteine d’adesione Vascular Adhesion Protein 1 (VAP-1), Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) e Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1). Scopo dello studio: Lo scopo dello studio è valutare l’espressione di IL-6, TNF, VAP- 1, ICAM-1 e VCAM-1 nei pazienti affetti da cirrosi con e senza neoplasia per verificare il ruolo svolto dall’infiammazione nel processo di carcinogenesi. Ulteriore obiettivo è l’identificazione di eventuali fattori prognostici e di possibili bersagli terapeutici. Materiali e metodi: Sono stati considerati 80 pazienti di cui 22 con cirrosi epatica, 44 con HCC insorto su cirrosi sottoposti a trattamenti loco-regionali e 14 con HCC insorto su cirrosi sottoposti a chirurgia. Tutti i pazienti avevano una cirrosi ad eziologia alcolica e sono stati trattati tra il 2002 e il 2012. Per ogni paziente è stato effettuato un prelievo di plasma precedente al trattamento o al momento della prima visita ambulatoriale. La cirrosi è stata stadiata mediante le classificazioni Child-Pugh, MELD e MELD-Na. Sono state inoltre valutati i seguenti parametri: ascite, encefalopatia, α-fetoproteina, dimensione del tumore, sopravvivenza. L’analisi dei livelli della forma solubile della VAP-1 è stata effettuata tramite test ELISA. IL-6, TNF, ICAM-1 e VCAM-1 sono state analizzate tramite il test Bio-Plex Suspension Array. L’analisi statistica relativa a VAP-1, IL6, TNF-α, ICAM-1 and VCAM-1, α-FP è stata effettuata utilizzando il test parametrico T-test. Gli altri parametri sono stati studiati mediante il test non parametrico di Wilcoxon. La sutido di sopravvivenza è stato effettuato utilizzando la regressione di Cox e il metodo di Kaplan-Meier method. La significatività statistica è stata indicata per P <0.05. Per l’analisi è stato utilizzato il software STATA/SE 11.1 (StataCorpLP, College Station, Texas, USA). Risultati: Nell’analisi dell’espressione delle proteine proinfiammatorie nei pazienti cirrotici con e senza epatocarcinoma sono risultati significativi i valori di VAP-1 e VCAM-1. Questi sono risultati significativamente più alti nei pazienti cirrotici con un a p=0,001 per VAP-1 e p=0,005 per VCAM-1. Le differenze di valori relative a IL6, ICAM-1, TNF e αFP non sono risultati statisticamente significative. Dopo un follow-up medio di 5 anni, la sopravvivenza mediana dei pazienti non operati è stata 38 mesi, mentre negli operati di 97 mesi. Solo le dimensioni del tumore e la presenza di ascite sono risultate significative all’analisi uni variata, dimostrando entrambe un valore prognostico negativo (dimensioni del tumore p=0,027, HR 1,01, CI 95% 1,24-5,85; ascite p=0,012, HR 2,7, CI 95% 1,24-5,85). Allo stesso modo anche alla multivariata sono risultati significativi solo dimensioni del tumore (p=0,033 HR 1,01, CI 95% 1,00083-1,02) e ascite (P=0,02, HR 2,54, CI 95% 1,159-5,57). Conclusioni: L’infiammazione promuove la tumorigenesi creando un microambiente infiammatorio e ossidativo che determina un danno cellulare e favorisce l’insorgenza di mutazioni genetiche. D’altro canto l’infiammazione contrasta l’insorgenza del tumore tramite il processo dell’immunosorveglianza. IL-6, VAP-1, ICAM-1 e VCAM-1 giocano un possibile ruolo nel controllo immunitario della neoplasia, per cui nei pazienti con tumore dovrebbero presentare valori inferiori. In questo studio però solo VAP-1 e VCAM-1 hanno confermato questa ipotesi. TNF, IL6 e ICAM-1 non sono risultate significative nonostante il loro importante ruolo nel contesto infiammatorio e probabilmente anche nel processo della carcinogenesi, e pertanto il loro ruolo nell’epatocarcinoma rimane da chiarire mediante ulteriori studi. Inoltre queste molecole non sono risultate significative dal punto di vista prognostico, a differenza dei due fattori clinici, ascite e dimensione del tumore. Forse la gravità della patologia epatica della popolazione presa in studio ha mascherato il loro effetto. Considerato quanto rilevato, i risultati preliminari non paiono conclusivi e pertanto sono necessari ulteriori studi per chiarire il ruolo delle citochine e delle proteine di adesione vascolare nella carcinogenesi. A riguardo nel prossimo lavoro l’obiettivo principale sarà quello di omogeneizzare il più possibile la popolazione in modo tale da poter suddividere la stessa per categorie di stadiazione e per eziologia, in modo da effettuare dei confronti fra i diversi gruppi con l’obiettivo di interpretare il ruolo di questi fattori nell’evoluzione dell’epatocarcinoma nei pazienti cirrotici.